[发明专利]运动发酵单胞菌RED重组系统表达质粒及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及运动发酵单胞菌RED重组系统的表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED及其构建方法与在运动发酵单胞菌中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

基因组重组系统主要有噬菌体重组系统和基因组编辑系统。噬菌体重组系统包括Red重组系统、RecET重组系统和P22重组系统。基因组编辑系统主要有锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALENS)和CRISPR/Cas系统。

Red重组系统是利用λ噬菌体的Redα/Redβ重组系统而建立的DNA重组技术，原理是将一段携带与靶基因两侧各有40～60 bp同源序列的PCR片段导入宿主菌细胞中，利用λ噬菌体Red 重组酶的作用，使导入细胞的线性DNA片段与染色体(或载体) 的特定靶序列进行同源重组，靶基因被敲入基因所置换。与常规的同源重组技术不同，该技术只需通过PCR在敲入基因两侧加上相对较短的与靶基因同源的序列，无须通过复杂的酶切、连接质粒等过程来建立上千bp的同源臂。Red重组系统在大肠杆菌中得到了大量的使用，除了用来敲除染色体上的基因外，还常被用来修改大肠杆菌内的载体或BAC质粒。Red重组系统来源于λ噬菌体Red区段，编码能够启动细菌染色体与外源DNA发生同源重组的蛋白质。噬菌体Red区段包括3个基因：bet、exo和gam 。Exo具有DNA外切核酸酶活性，能以每秒钟1000个碱基的速度从双链DNA末端按5′→3′的方向降解单链DNA，Exo蛋白与单链DNA分子结合需要至少35个碱基的区域, 因此供体DNA需要35bp以上的靶位点同源臂。bet基因编码的Beta蛋白是一个单链DNA(ssDNA)结合蛋白，它可以结合到由Exo产生的3’单链DNA末端，从而启动互补DNA链的退火，引发DNA链的交换反应。Beta蛋白还可与Exo外切核酸酶形成复合体，调节核酸溶解和重组启动。gam基因的表达产物Gam蛋白与宿主的RecBCD复合体结合并抑制宿主外切核酸酶活性，阻止外源线状DNA片段被降解。当Beta蛋白与单链DNA 3′突出端结合形成丝状体后，重组机制分为两种：若参与重组的另一同源序列为没有断裂的双螺旋DNA链，单链DNA在RecA蛋白的作用下侵入双链DNA，完成重组过程，这一机制称为链侵入模型；若另一同源序列为单链DNA，比如DNA复制过程中的复制叉，Beta蛋白介导互补单链DNA退火，完成重组过程，这一机制称为单链退火模型。

目前，Red同源重组技术的研究主要在大肠杆菌进行，此外也用于其他一些细菌如痢疾杆菌、柠檬酸菌和沙门氏菌。此外相关研究说明RED重组技术在真核生物细胞中也可以实现。

外源基因在Z. mobilis中进行表达并不容易达到满意的效果，如将黑曲霉糖化酶基因转入Z. mobilis中，无法获得稳定表达的重组菌株；乳糖操纵子在Z. mobilis的表达不能使其在以乳糖为唯一碳源的培养基上生长；枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因转入Z. mobilis未检测到生物活性；木糖代谢相关基因转入Z. mobilis往往不能使其在木糖为唯一碳源的培养基上生长，或是可以生长但生长和产醇速率要比在葡萄糖培养基上的低4-5倍。此外，要将Z. mobilis用于大规模乙醇生产，不仅要扩大其底物利用范围，还有必要减少其副产物的产生，如山梨醇、3-羟基丁酮、甘油、乙醛、乙酸和胞外果聚糖等。因此，为了获得乙醇生产效率高、且能利用多种碳源的运动发酵单胞菌基因工程菌，往往需要较大规模地删除或插入多个基因，因此构建运动发酵单胞菌RED重组系统具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供运动发酵单胞菌中RED重组系统表达质粒pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED和pSUZM3a-RED的构建。

本发明提供的运动发酵单胞菌中RED重组系统表达质粒分别命名为pSUZM1a-RED、pSUZM2a-RED、pSUZM3a-RED。

其中pSUZM1a-RED包含运动发酵单胞菌染色体复制起点oriC、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自于运动发酵单胞菌的组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc和来自质粒pKD46的RED基因。

其中pSUZM2a-RED包含运动发酵单胞菌内源性质粒pZZM401上的复制蛋白序列、质粒pUC18上的复制起点、卡那霉素筛选标记基因、来自于组成型基因启动子-丙酮酸脱羧酶pdc基因的启动子Ppdc和来自质粒pKD46的RED基因。