[发明专利]一种芝麻染色体荧光原位杂交方法有效
申请号: | 201410322009.4 | 申请日: | 2014-07-08 |
公开(公告)号: | CN104099416A | 公开(公告)日: | 2014-10-15 |
发明(设计)人: | 张海洋;苗红梅;赵瑞红;李春;马琴;魏利斌;段迎辉 | 申请(专利权)人: | 河南省农业科学院芝麻研究中心 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 郑州联科专利事务所(普通合伙) 41104 | 代理人: | 时立新;杨海霞 |
地址: | 450000 *** | 国省代码: | 河南;41 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 芝麻 染色体 荧光 原位杂交 方法 | ||
1.一种芝麻染色体荧光原位杂交方法,其特征在于,包括如下步骤:
A、染色体标本的制备;
B、BAC探针制备:
1)BAC质粒DNA提取
从芝麻BAC库中挑出目的BAC克隆,培养后,采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA,质粒DNA浓度100-500 ng/μL;
2)探针标记
取20μL BAC DNA,0.1Kpa、120℃下放置5min,然后冰浴放置5min,随机引物法进行探针标记,37℃水浴20h,65℃灭活5min,-20℃保存备用;标记体系见表1;
表1探针荧光标记反应体系
C、荧光原位杂交
将标记好的探针用杂交液稀释10倍作为工作液用于荧光原位杂交;工作液各组分见表2;
表2 荧光原位杂交所用工作液组成
1)染色体制片处理
将染色体制片浸泡于45%乙酸中1-2min,取出自然晾干,褪去吉姆萨染液颜色;37℃下用含100μg/mL RNase A的2×SSC处理制片标记区1h;然后用2×SSC洗片三次,每次5min;使用70%、85%及无水乙醇对制片逐级脱水,每级3-5min;
自然晾干后, 37℃下用1%胃蛋白酶处理制片标记区30min,1×PBS洗2次,每次5min;然后用1%多聚甲醛处理制片标记区10min,2×SSC洗2次,每次5min,自然晾干;
在制片标记区加70%去离子甲酰胺,加盖片,70℃变性2min;将变性后的制片进行脱水,依次置于-20℃预冷的70%、85%及无水乙醇中逐级脱水,每级3-5min,自然晾干备用;
2)探针变性
取20μL工作液,95℃变性10min,冰浴5min以上,备用;
3)杂交
制片标记区内加工作液8μL,加盖片,胶水封边,37℃杂交过夜;
4)信号检测
室温下2×SSC液浸泡制片,洗去盖片,含0.1 wt % SDS的 2 ×SSC浸洗3次,每次5min;然后用蒸馏水冲洗一遍,避光晾干;在制片标记区滴入4μL含4μg/mL DAPI 的Vectashield H1000,加盖片置于Nikon 80i荧光显微镜下,根据制片坐标确定目标染色体,观察杂交信号,冷光源CCD下进行图像采集,采用Spot Rtke 4.1软件进行图像合成,并利用Adobe Photoshop 7.0软件对图像进行调整。
2.如权利要求1所述的芝麻染色体荧光原位杂交方法,其特征在于,步骤A染色体标本的制备具体为:
1)根尖培养
选取健康芝麻种子,播于铺有湿滤纸的培养皿中,21℃暗培养至根长1.2-1.8cm;
2)根尖处理
切取4-5mm含分生区的根尖置于玻瓶中,浸入0.002 M 8-羟基喹啉于21℃暗处理1.5h,倒出液体,直接加入由体积比为3:1的无水甲醇和冰乙酸组成的固定液4℃固定1h;
取出根尖于蒸馏水中清洗2-3次,切取根尖分生区于蒸馏水中浸泡10-20min,然后按每10个根尖分生区加入20μl含2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的混合酶液于37℃水浴中酶解2-3h;取出根尖分生区,蒸馏水洗去酶液,然后蒸馏水中浸泡10-20min;然后将根尖分生区再次移至固定液中4℃固定1h;
3)涂片
用胶头滴管吸取根尖分生区,置于已于4℃预冷的干净玻片上,用尖头镊子尖端将根尖分生区敲碎制成局部细胞悬液;然后滴加固定液使悬液分散于整个玻片,自然晾干;
4)染色
玻片倒置于一玻璃板上,两端用毛细管支起,使玻片与玻璃板之间留有空隙,将吉姆萨染液注入此空隙,染色15min,然后自来水冲洗,自然晾干;
5)镜检
在Nikon 80i荧光显微镜下,挑选处于有丝分裂中期的染色体制片,在背面标记目的染色体所在范围,即标记区,记录其在玻片上对应的坐标位置。
3.如权利要求1所述的芝麻染色体荧光原位杂交方法,其特征在于,将杂交后的制片标本进行后处理用以重复利用,具体为:揭去盖片后,用含0.2% Tween20的2×SSC浸洗10min,然后蒸馏水冲洗一次,自然晾干,重复上述C步骤中的变性、脱水处理,即可用于另一组探针的原位杂交检测。
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