[发明专利]一种芝麻染色体荧光原位杂交方法

权利要求书

1.一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、染色体标本的制备；

B、BAC探针制备：

1）BAC质粒DNA提取

从芝麻BAC库中挑出目的BAC克隆，培养后，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，质粒DNA浓度100－500 ng/μL；

2）探针标记

取20μL BAC DNA，0.1Kpa、120℃下放置5min，然后冰浴放置5min，随机引物法进行探针标记，37℃水浴20h，65℃灭活5min，-20℃保存备用；标记体系见表1；

表1探针荧光标记反应体系

C、荧光原位杂交

将标记好的探针用杂交液稀释10倍作为工作液用于荧光原位杂交；工作液各组分见表2；

表2 荧光原位杂交所用工作液组成

1）染色体制片处理

将染色体制片浸泡于45%乙酸中1－2min，取出自然晾干，褪去吉姆萨染液颜色；37℃下用含100μg/mL RNase A的2×SSC处理制片标记区1h；然后用2×SSC洗片三次，每次5min；使用70%、85%及无水乙醇对制片逐级脱水，每级3－5min；

自然晾干后， 37℃下用1%胃蛋白酶处理制片标记区30min，1×PBS洗2次，每次5min；然后用1%多聚甲醛处理制片标记区10min，2×SSC洗2次，每次5min，自然晾干；

在制片标记区加70%去离子甲酰胺，加盖片，70℃变性2min；将变性后的制片进行脱水，依次置于-20℃预冷的70%、85%及无水乙醇中逐级脱水，每级3－5min，自然晾干备用；

2）探针变性

取20μL工作液，95℃变性10min，冰浴5min以上，备用；

3）杂交

制片标记区内加工作液8μL，加盖片，胶水封边，37℃杂交过夜；

4）信号检测

室温下2×SSC液浸泡制片，洗去盖片，含0.1 wt % SDS的 2 ×SSC浸洗3次，每次5min；然后用蒸馏水冲洗一遍，避光晾干；在制片标记区滴入4μL含4μg/mL DAPI 的Vectashield H1000，加盖片置于Nikon 80i荧光显微镜下，根据制片坐标确定目标染色体，观察杂交信号，冷光源CCD下进行图像采集，采用Spot Rtke 4.1软件进行图像合成，并利用Adobe Photoshop 7.0软件对图像进行调整。

2.如权利要求1所述的芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，步骤A染色体标本的制备具体为：

1）根尖培养

选取健康芝麻种子，播于铺有湿滤纸的培养皿中，21℃暗培养至根长1.2－1.8cm；

2）根尖处理

切取4－5mm含分生区的根尖置于玻瓶中，浸入0.002 M 8-羟基喹啉于21℃暗处理1.5h，倒出液体，直接加入由体积比为3:1的无水甲醇和冰乙酸组成的固定液4℃固定1h；

取出根尖于蒸馏水中清洗2－3次，切取根尖分生区于蒸馏水中浸泡10－20min，然后按每10个根尖分生区加入20μl含2.5%纤维素酶和2.5%果胶酶的混合酶液于37℃水浴中酶解2－3h；取出根尖分生区，蒸馏水洗去酶液，然后蒸馏水中浸泡10－20min；然后将根尖分生区再次移至固定液中4℃固定1h；

3）涂片

用胶头滴管吸取根尖分生区，置于已于4℃预冷的干净玻片上，用尖头镊子尖端将根尖分生区敲碎制成局部细胞悬液；然后滴加固定液使悬液分散于整个玻片，自然晾干；

4）染色

玻片倒置于一玻璃板上，两端用毛细管支起，使玻片与玻璃板之间留有空隙，将吉姆萨染液注入此空隙，染色15min，然后自来水冲洗，自然晾干；

5）镜检

在Nikon 80i荧光显微镜下，挑选处于有丝分裂中期的染色体制片，在背面标记目的染色体所在范围，即标记区，记录其在玻片上对应的坐标位置。

3.如权利要求1所述的芝麻染色体荧光原位杂交方法，其特征在于，将杂交后的制片标本进行后处理用以重复利用，具体为：揭去盖片后，用含0.2% Tween20的2×SSC浸洗10min，然后蒸馏水冲洗一次，自然晾干，重复上述C步骤中的变性、脱水处理，即可用于另一组探针的原位杂交检测。