[发明专利]一种芝麻染色体荧光原位杂交方法

说明书

技术领域    

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种芝麻染色体制片与BAC荧光原位杂交方法。

背景技术

染色体制片和细菌人工染色体荧光原位杂交(BAC-FISH)技术是开展生物DNA片段染色体定位、物理图谱构建等细胞遗传学研究的重要技术手段。目前在芝麻染色体核型分析研究中，所使用的染色体制片方法均为传统的压片方法；而且尚未见任何制片技术在芝麻BAC-FISH研究中的应用报道。在制作染色体标本时，传统的压片法需要对染色体标本进行敲片、盖片处理，染色体容易变形；在进行原位杂交时，染色体标本因处于细胞质包裹中，往往其背景信号较强，对杂交信号的观察干扰较大；而且中间操作过程中的揭片环节极有可能导致染色体丢失，从而导致制片效率低、费工费时。此外，传统压片技术不利于制片的多次重复使用，这也很大程度地影响了原位杂交技术在芝麻物理图谱构建和特定片段染色体定位研究中的应用。因此，当前急需探讨一种稳定高效快速的芝麻染色体制片方法和BAC-FISH杂交技术，为加快芝麻细胞遗传学和基因组学研究提供技术支撑。

发明内容

为克服现有技术不足，本发明目的在于提供一种高效便捷的芝麻染色体荧光原位杂交技术方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种芝麻染色体荧光原位杂交方法，其包括如下步骤：

A、染色体标本的制备；

B、BAC探针制备：

1）BAC质粒DNA提取

从芝麻BAC库中挑出目的BAC克隆，培养后，采用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，质粒DNA浓度100－500 ng/μL；

2）探针标记

取20μL BAC DNA，0.1Kpa、120℃下放置5min，然后冰浴放置5min，随机引物法进行探针标记，37℃水浴20h，65℃灭活5min，-20℃保存备用；标记体系见表1；

表1探针荧光标记反应体系

C、荧光原位杂交

将标记好的探针用杂交液稀释10倍作为工作液用于荧光原位杂交；工作液各组分见表2；

表2 荧光原位杂交所用工作液组成

1）染色体制片处理

将染色体制片浸泡于45%乙酸中1－2min，取出自然晾干，褪去吉姆萨染液颜色；37℃下用含100μg/mL RNase A的2×SSC处理制片标记区1h；然后用2×SSC洗片三次，每次5min；使用70%、85%及无水乙醇对制片逐级脱水，每级3－5min；

自然晾干后， 37℃下用1%胃蛋白酶（10mM HCl配制）处理制片标记区30min，1×PBS洗2次，每次5min；然后用1%多聚甲醛处理制片标记区10min，2×SSC洗2次，每次5min，自然晾干；

在制片标记区加70%去离子甲酰胺（2×SSC），加盖片，70℃变性2min；将变性后的制片进行脱水，依次置于-20℃预冷的70%、85%及无水乙醇中逐级脱水，每级3－5min，自然晾干备用；

2）探针变性

取20μL工作液，95℃变性10min，迅速冰浴5min以上，备用；

3）杂交

制片标记区内加工作液8μL（可等量加入2－3种荧光素的探针），加盖片，胶水封边，37℃杂交过夜；

4）信号检测

室温下2×SSC液浸泡制片，洗去盖片，2 ×SSC（含0.1 wt % SDS）浸洗3次，每次5min；然后用蒸馏水冲洗一遍，避光晾干；在制片标记区滴入4μL含4μg/mL DAPI 的Vectashield H1000，加盖片置于Nikon 80i荧光显微镜下，根据制片坐标确定目标染色体，观察杂交信号，冷光源CCD下进行图像采集，采用Spot Rtke 4.1软件进行图像合成，并利用Adobe Photoshop 7.0软件对图像进行调整。

步骤A染色体标本的制备具体为：

1）根尖培养

选取健康芝麻种子，播于铺有湿滤纸的培养皿中，21℃暗培养至根长1.2－1.8cm（优选1.5cm）；

2）根尖处理

切取4－5mm含分生区的根尖置于玻瓶中，浸入0.002 M 8-羟基喹啉于21℃暗处理1.5h，倒出液体，直接加入由体积比为3:1的无水甲醇和冰乙酸组成的固定液（现用现配）4℃固定1h；