[发明专利]一种鲍铁蛋白的粗提方法

说明书

技术领域

本发明蛋白提取方法，尤其是涉及一种鲍铁蛋白的粗提方法。

背景技术

铁蛋白（ferritin）是动植物体内普遍存在的、高度保守的一类贮存铁的胞内可溶性蛋白。不同动物铁蛋白的结构相似，均为球型。其外径约12～14nm，空囊腔径长约6nm，外壳（即脱铁铁蛋白）由24个亚基组成，由重链和轻链两种亚基按等比例形成。重链分子量约为21kDa，轻链分子量约为19kDa。完整铁蛋白的分子量约为480kDa，每个分子可结合多达4500个铁原子，在球体中间形成一个致密的铁核。铁蛋白由于其高度的稳定性和球型对称的分子结构，使其在生物医学及纳米材料科学领域得到了广泛的应用。然而，目前国内外均未见鲍铁蛋白提取方法的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从软体动物鲍的组织中提取铁蛋白的鲍铁蛋白的粗提方法，该方法操作简便、快速且样品损失量少，提取的铁蛋白纯度较高。

为实现本发明的目的，本发明采用以下方法：一种鲍铁蛋白的粗提方法，包括以下步骤：

(1) 取除性腺外的鲍组织，加入SB缓冲液，匀浆，得匀浆液；

(2)匀浆液置于液氮和水浴中反复冻融；

(3)用SB缓冲液定容至总体积100mL，混匀后冷冻离心，收集上清液；

(4) 上清液经滤膜过滤，离心，弃上清，加入SB缓冲液重悬沉淀物得重悬液；

(5) 将重悬液加到CsCl密度梯度液的液面上，离心，弃上清，得红褐色的铁蛋白。

所述步骤(1)中鲍组织与SB缓冲液之间的质量体积比为1﹕2~1﹕50(g/ml)。

所述步骤(1)中SB缓冲液的pH为6.0~8.0，含有0.1~0.3M NaCl，20~100mM Tris-HCl，1~20mM CaCl₂，1~20mM MgCl₂。

所述步骤(2)中匀浆液置于液氮和水浴中反复冻融的次数为3次。水浴温度为20~80℃。

所述步骤(3)中冷冻离心是采用高速冷冻离心机依次以转速1000~5000rpm、6000~8000rpm、9000~10000rpm和11000~14000rpm对定容后的溶液离心10~60min。

所述步骤(4)中滤膜的孔径为0.22~0.45um。

所述步骤(4)中对滤膜过滤所得的溶液使用超速离心机以转速15000~40000 rpm离心0.5~3h。

所述步骤(4)中用于重悬的SB缓冲液的量为0.5~3mL。

所述步骤(5)中，CsCl密度梯度液采用SB缓冲液配置，从离心管管底到管顶的溶液质量比分别为40~60%、30~40%、20~30%、10~20%。

所述步骤(5)中使用超速离心机以转速15000~40000 rpm离心0.5~3h。

与现有技术相比，本发明具有如下显著的效果：

本发明提供的方法主要以超速离心分离方法为基础，操作简便、快速且样品损失量少，该方法提取的铁蛋白纯度较高，仅有少量血蓝蛋白干扰（参见图3），具有较好的应用前景。

附图说明

图1是超速离心后的铁蛋白沉淀，

左侧为杂色鲍，右侧为皱纹盘鲍。

图2是铁蛋白电镜照片，

左图是经磷钨酸负染后的铁蛋白，右图是未经磷钨酸负染的铁蛋白铁核。

图3是铁蛋白SDS-PAGE检测结果，

图中可见铁蛋白的两个亚基分子量分别约为21kD和19kD；胶孔处有少量杂蛋白（主要为血蓝蛋白）；1号样为皱纹盘鲍，2和3号样为杂色鲍。

图4是实施例1中杂色鲍的疑似铁蛋白目标条带的重链的质谱鉴定结果。

图5是实施例1中杂色鲍的疑似铁蛋白目标条带的轻链的质谱鉴定结果。

图6是实施例3中皱纹盘鲍的疑似铁蛋白目标条带的重链的质谱鉴定结果。

图7是实施例3中皱纹盘鲍的疑似铁蛋白目标条带的轻链的质谱鉴定结果。

具体实施方式

实施例1

鲍铁蛋白的提取