[发明专利]油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法

说明书

技术领域

本发明属于油桐细胞工程领域,具体涉及一种利用油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法。

背景技术

油桐为大戟科(Euphorbiaceae)油桐属(Vernicia)植物的统称,是重要的工业油料树种,与油茶、核桃和乌桕并称我国四大木本油料树种。从油桐种子榨取的油称为桐油,是世界上最优质的植物干性油,为油漆、印刷墨油的优良原料。桐油具有干燥快、附着力强、比重轻、富光泽、耐酸碱、耐高温、抗冻裂、防水等优良特性。此外,桐油还是一种优良涂料,是合成新型复合材料的基本原料,具有广泛的用途。近年来,随着全球人口增加和经济的飞速增长,资源开发利用过度,发展油桐产业已迫在眉睫,如何挖掘油桐这一宝贵资源在生物质能源等领域的重要作用,推进油桐规模化发展是当前科研工作者艰巨的任务,也是帮助山区农民脱贫致富的手段之一。目前,油桐的常规育苗方法主要为实生苗及嫁接苗,嫁接苗虽然能够保持母本的优良性状,但成本较高,不利于规模化生产。同时,油桐枯萎病是我国油桐产区一种毁灭性病害,严重影响了油桐产业的稳定发展。通过组织培养可以快速繁殖油桐脱毒苗,在此基础上通过遗传体系转化而获得抗病植株,在木本油料植物遗传改良方面有广阔的前景。

油桐的离体培养研究很晚,到目前为止仅有以油桐离体叶片通过器官发生途径获得再生植株的报道,但由于叶片较嫩,在农杆菌侵染过程中特别容易受伤,再生活性降低,对实现油桐的遗传体系转化产生很大的障碍,并且,叶片容易失水,对卡那霉素的抗性较低,在卡那霉素筛选过程中容易死亡,而下胚轴是通过合子胚发育而来胚性器官,胚性较强,具有很高的活力及分化再生能力,在植物遗传体系转化中有广阔的前景。目前,通过农杆菌侵染下胚轴获得转基因植株已经在油菜及柑橘中获得成功,而这些植物通过离体叶片也可以获得再生植株,但在农杆菌侵染时的过程中,以及在卡那霉素筛选中叶片容易死亡,不能获得转基因植株,相反,这些植物的下胚轴对卡那霉素的抗性较强,有利于目的基因的介导、转化和再生。因此,通过利用油桐下胚轴愈伤组织诱导获得再生植株在油桐转基因领域有广阔的前景。本发明以油桐幼嫩的下胚轴为外植体,通过在高浓度的激素下诱导愈伤组织,然后转接到愈伤组织分化不定芽的培养基中进行不定芽的分化、继代增殖、生根和炼苗移栽等过程,旨在建立一个高效稳定的油桐下胚轴离体快繁体系,为油桐遗传改良奠定基础。

发明内容

本发明的目的是针对目前油桐采用叶盘法获得再生植株技术存在的缺陷,在此基础上,提供了利用油桐下胚轴愈伤组织诱导获得再生植株,该方法利用油桐幼嫩的下胚轴诱导愈伤组织,再通过愈伤组织分化不定芽,其诱导率高,不定芽健壮,不定芽继代增殖系数高,壮苗效果好,生根率高,关键还在于能够大大提高农杆菌浸染实现遗传转化的可能性。

本发明的目的是通过以下方式实现的。

油桐下胚轴愈伤组织诱导及高效再生植株的方法,包括以下步骤:

将油桐成熟胚在无菌条件下萌发30天的下胚轴,在无菌条件下切成长为0.5-1.0cm的小块,接种到WPM+5.0-10.0mg/L6-BA+1.0mg/L KT+0.1mg/L NAA的培养基中诱导愈伤组织,暗培养3天后,转到光照条件下培养10天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d；然后经过不定芽分化、继代增殖、壮苗和生根培养获得完整植株；最后进行炼苗、移栽。

上述方法中不定芽分化的具体过程如下:将下胚轴诱导的质地较好的愈伤组织接种到WPM+0.5-1.0mg/L6-BA+0.01-0.05mg/L NAA+2.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的分化培养,暗培养1天后,转到光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。

上述方法中继代增殖培养的具体过程如下:将愈伤组织分化培养得到的健壮不定芽切下接种到WPM+2.0-3.0mg/L KT+0.05mg/L IAA+2.0mg/L GA₃的培养基中进行不定芽的增殖培养,暗培养1天后,在光照条件下培养25-30天；培养温度为26士1℃,光照强度为2100-2200lx,光照时间12-14h/d。