[发明专利]一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物检测试剂，以及这种检测试剂的制备方法，确切讲本发明涉及一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法。

背景技术

牛支原体是感染牛的一种重要的致病性病原体, 1961 年Hale 在美国首次从患乳腺炎的牛乳中分离到该病原, 1976 年首次报道与牛呼吸系统疾病有关。目前已证实牛支原体除导致牛肺炎、乳腺炎外, 还可导致关节炎、角膜结膜炎、耳炎、生殖道炎症、流产与不孕等多种疾病。自2008 年以来, 我国部分地区新从外地引进肉牛暴发了以坏死性肺炎为主要特征的“传染性牛支原体肺炎” 疫情, 发病率为50%-100%, 病死率高达10%-50% , 给我国养牛业造成了巨大的经济损失。此后相继在我国甘肃、宁夏、青海、贵州、内蒙、湖北、重庆、山东等省市均有临床诊断报道，危害严重。但遗憾的是，迄今这些报道大多为根据临床表现和剖检变化做出的临诊报告，鲜见应用准确的实验室诊断技术。因此，本病在我国的实际流行情况和准确的流行病学信息仍较为匮乏，造成这种现象的原因，主要是我国目前缺乏有效的牛支原体检测的相关技术。

目前存在的检测牛支原体的技术有：1.病原分离鉴定，但是牛支原体分离往往受到临床应用抗生素的影响，分离困难，且分离用培养基营养要求高、分离物鉴定难度大、灵敏度低, 不能作为早期快速诊断牛支原体感染的方法, 也难以作为常规检测方法普及推广（参见Caswell J L, Archambault M. Mycoplasma bovis pneumonia in cattle）；2.PCR检测方法（参见Thomas A, Dizier I, Linden A, et al .Conservation of the uvrC gene sequence in Mycoplasma bovis and its use in routine PCR diagnosis），该检测方法需要对病料样品进行较复杂的处理（研磨、离心、提取DNA等），检测方法虽灵敏，但容易因污染和处理不当比较容易出现假阳性，影响判定结果的准确性，此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，以及较高成本，不适合临床或基层使用。3.间接ELISA 是目前应用最主要的血清学检测方法，国际上先后有用全菌蛋白包被和表达蛋白作为包被抗原的方法（出自Grand D L, Calavas D, Brank M, et al. Serological prevalence of Mycoplasma bovis infection in suckling beef cattle in France），全菌蛋白的方法特异性不足现已很少应用，表达蛋白抗原ELISA方法目前已有商业化产品，但其所用哪一个抗原蛋白并未公布。此外，ELISA方法仅适合在实验室进行检测，操作步骤相对复杂，需要专业人员进行操作，且需要一定的实验室条件和仪器设备进行检测和分析结果。我们利用P48重组表达蛋白包被绵羊红细胞建立的间接血凝检测方法，操作简单，无需特定的仪器设备，2~3小时即可判定结果，实验室检测和基层临床均可应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决当前我国缺乏牛支原体抗体检测技术难题，提供一种牛支原体抗体检测试剂及其制备方法，本发明同时提供用这种抗原制备间接血凝诊断试剂的方法。

本发明的牛支原体抗体检测试剂由混合均匀的1份牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗原和1份10%醛化-鞣酸化绵羊红细胞（v/v）构成。

本发明的牛支原体抗体检测试剂制备方法是：

a. 将牛支原体p48基因合成到pet32a表达载体质粒中，得到阳性重组质粒Pet32-a(+)-p48；

b. 用重组质粒pet32a(+)-p48转化到感受态细胞BL21（DE3）,挑取已转化到BL21(DE3)的单菌落接种于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至OD值至0.6左右，然后吸取一定量的该菌液接种到的含氨苄青霉素的LB液体培养基诱导表达，收集菌体后过柱纯化，得牛支原体P48融合蛋白；

c. 用1份纯化的P48融合蛋白抗原与1份10%醛化-鞣酸化绵羊红细胞(v/v)混合均匀得到检测试剂。

本发明的牛支原体抗体检测试剂中使用的牛支原体P48重组表达的融合蛋白抗原基因序列为SEQ ID №1。