[发明专利]一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法

权利要求书

1.一种生产堇菜黄素的方法，其特征是由以下步骤构成：

(1)克隆拟南芥玉米黄素环氧化酶基因AtZEP；

(2)构建含有重组拟南芥玉米黄素环氧化酶基因的载体；

(3)通过IPTG诱导在大肠杆菌体内大量表达重组拟南芥玉米黄素环氧化酶；

(4)通过连续培养的方法在大肠杆菌体内表达可溶重组拟南芥玉米黄素环氧化酶。

2.根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于使用下列序列的引物扩增拟南芥玉米黄素环氧化酶基因：

上游：5'-CATGCCATGGCAATGGGTTCAACTCCGTTTTGCTAC-3'(SEQ ID NO.1),

下游：5'-CGGGATCCTCAAGCTGTCTGAAGTAATTTA-3'(SEQ ID NO.2)。

3.根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于将权利要求2扩增得到的片段克隆至pMAL-C5X载体，获得的重组质粒名为pMAL-CX5-AtZEP。

4.根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于将携带权利要求3所述重组质粒的大肠杆菌Rosetta2(DE3)pLysS菌株于37℃需氧条件下，在TB培养基中培养至OD_600nm为0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度0.1～0.4mM，28℃继续培养3～6小时,诱导蛋白表达的菌液继续在原条件下培养24～72小时，离心收集的菌体呈现橙黄色，以1％～10％终浓度的SDS溶液重悬菌体并以乙酸乙酯萃取总色素，主要成分为堇菜黄素。

5.根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法，其特征在于将携带权利要求3所述重组质粒的大肠杆菌DH5α菌株于28℃需氧条件下，在改良的TB培养基中培养24～72小时，离心收集的菌体呈现橙黄色，以1％～10％终浓度的SDS溶液重悬菌体并以乙酸乙酯萃取总色素，主要成分为堇菜黄素。

6.根据权利要求1所述生产堇菜黄素的方法生产的堇菜黄素在食品工业、保健品行业或作为高纯度的化合物标准品在科研领域中的应用。