[发明专利]一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种依赖大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法。

背景技术

堇菜黄素(violaxanthin)是一种在高等植物中广泛存在的天然类胡萝卜素，存在于大多数高等植物的叶片、花、果实等器官中，例如菠菜的叶片、三色堇的花瓣以及橙子的果皮等。

在绝大多数高等植物体内，堇菜黄素是叶黄素循环的下游终产物，也是叶黄素循环中的主要积累色素。叶黄素循环的色素组分有3种：玉米黄素(zeaxanthin)、花药黄素(antheraxanthin)和堇菜黄素(violaxanthin)。这3种组分在不同的光照条件下，通过环氧化反应或者去环氧化反应相互转化。堇菜黄素在堇菜黄素去环氧化酶(VDE)的催化下，依次生成花药黄素和玉米黄素；在氧气以及铁氧还蛋白或NADPH存在的情况下，玉米黄素环氧化酶(ZEP)将玉米黄素环氧化，依次生成花药黄素和堇菜黄素。在黑暗或者不饱和光下，堇菜黄素是叶黄素循环中的主要色素，当正午叶片中吸收的光能超过光合作用的最大利用能力时，堇菜黄素转变为花药黄素和玉米黄素，将过剩的光能以热能形式耗散；反之当进入夜晚，玉米黄素又变为花药黄素和堇菜黄素。因此，堇菜黄素在植物体内具有重要的光保护功能。除此之外，堇菜黄素及其异构体新黄素(neoxanthin)是重要的植物抗逆激素脱落酸的生物合成前体，在植物抗旱、抗盐等生理过程中发挥极其重要的作用。

克隆拟南芥玉米黄素环氧化酶的编码基因，对于更好地开发拟南芥资源具有重要的现实意义。一方面，通过植物基因工程手段，增强植物体内玉米黄素环氧化酶基因的表达，有利于提高植物内源堇菜黄素的含量，并进而提高内源脱落酸的含量，增强植物的抗逆性；另一方面，将能够利用大肠杆菌内源前体催化合成玉米黄素的质粒pAC-ZEAX以及本发明构建的重组质粒pMAL-C5X-AtZEP共同转化大肠杆菌，可以通过发酵生产大量高纯度的堇菜黄素。

现有的生产堇菜黄素的技术，因其在天然植物组织中的含量较少、化学合成成本高且副产物多等诸多原因而价格昂贵，极大地限制了其在食品工业和科研领域中的应用。例如从10千克新鲜的菠菜叶片中仅能提取出约200毫克堇菜黄素。而利用基因工程技术，选择遗传背景明确、安全无毒性、科学研究和微生物发酵工程中最为广泛应用的模式生物大肠杆菌，通过发酵以及成本低廉的纯化过程，得到大量高纯度的堇菜黄素是促进其在食品工业和科研中应用的有效途径。

发明内容

本发明需要解决的问题是提供一种通过大肠杆菌发酵生产堇菜黄素的方法，主要内容包括拟南芥玉米黄素环氧化酶基因AtZEP的克隆，AtZEP融合麦芽糖结合蛋白标签(MBP-tag)原核表达载体的构建，载体的共转化，玉米黄素环氧化酶在大肠杆菌体内的可溶性表达以及通过发酵生产堇菜黄素并提取总色素。