[发明专利]1型糖尿病易感位点rs231775的检测方法及试剂盒

说明书

【技术领域】

本发明涉及一种1型糖尿病易感性的检测方法及试剂盒，更具体的说是通过测定与1型糖尿病相关基因细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T lymphocyte-associatedantigen4，CTLA-4)的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)预测受试者对于1型糖尿病的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于分子生物学和医学领域。

【背景技术】

糖尿病是常见病、多发病，其患病率正随人民生活水平的提高、人口老化和生活方式的改变迅速增加。据世界卫生组织(WHO)估计，全球目前有超过1.5亿糖尿病患者，到2025年这一数字将增加一倍。我国现有糖尿病患者3千万，居世界第2位。糖尿病已成为发达国家中继心血管病和肿瘤之后的第三大非传染性疾病，对社会和经济带来沉重的负担，是严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。根据WHO和国际糖尿病联盟(IDF)专家组的建议，糖尿病可分为1型、2型、其他特殊类型及妊娠糖尿病四种。研究表明，1型糖尿病占糖尿病总发病人数的1％～10％，且近年来该病的发病率呈逐年上升趋势。

糖尿病的病因和发病机制较为复杂，至今尚未完全明了。目前认为1型糖尿病(type I diabetes，T1DM)是一种在遗传与环境相互作用下，以T细胞介导的特异性胰岛β细胞自身免疫性破坏为主要发病机制的一种疾病。1型糖尿病具有多基因遗传背景，易感性十分复杂，疾病的发生是多种基因相互作用、相互影响的结果。近年来，随着对1型糖尿病相关基因的研究日趋深入，证实了多种基因在1型糖尿病的发生发展中的作用，为1型糖尿病的早期诊断和治疗提供了理论依据。

细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4基因位于染色体2q33，编码T细胞表面的一种膜蛋白。研究表明，只有激活的T细胞才表达CTLA-4分子，并与抗原递呈细胞膜上的B7分子结合，传递负性调节信号，终止T细胞活化和抑制免疫反应的进行，对T细胞增生起负性调节作用。研究表明CTLA-4基因外显子I第17密码子49位点A/G多态性(rs231775)，导致CTLA-4信号肽区域内的苏氨酸变为丙氨酸，与机体免疫应答的过度激活相关，是1型糖尿病的独立危险因素之一。

现有技术检测1型糖尿病易感人群，采用杂交芯片法或玻璃板芯片法，以及采用taqman探针，前两种方法准确率低、假阴性和假阳性率较高，且不能批量检测；另一种直接测序法虽然准确率高，但其成本也很高，同样很难实现批量检测。

因此，有必要提出一种新的检测方法以解决上述问题。

【发明内容】

本发明的主要目的是提供一种辅助诊断1型糖尿病的方法，该方法操作简单、快速，使用成本低，结果准确，可以实现批量检测。

本发明的另一目的是提供一种用于检测1型糖尿病易感位点的试剂盒，该试剂盒包括PCR引物及含有该引物的试剂盒，其可以实现扩增与HRM分析。

为了解决上述问题，本发明采用的技术方案是：一种检测1型糖尿病易感位点的方法，包括如下步骤：(1)提取样品的基因组DNA，扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域，得到扩增产物；(2)使用HRM分析技术检测扩增产物中SNP位点的基因型。

进一步的，CTLA-4基因的rs231775位点的基因型带有GG时，该CTLA-4基因所属样品的测试者对于1型糖尿病的易感性高于基因型不带GG的测试者。

进一步的，使用特异性引物扩增样品的CTLA-4基因外显子中包含rs231775位点的区域，该特异性引物是指针对CTLA-4基因上rs231775号SNP位点而设计，能特异性扩增出包含上述SNP位点的DNA片段的引物对。

进一步的，所述特异性引物具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步的，使用HRM分析技术直接检测扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对的基因型。

进一步的，将扩增后包含上述SNP位点的DNA片段的引物对转移至分析装置，然后使用HRM分析技术对该引物对的基因型进行分析。

进一步的，所述1型糖尿病易感位点的检测方法在体外非诊断性检测1型糖尿病易感性方面的应用。

为了解决上述问题，本发明采用的另一技术方案是：一种用于检测1型糖尿病易感位点的试剂盒，其可以对CTLA-4基因外显子中包含rs231775号位点的区域进行扩增及HRM技术分析。