[发明专利]一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子纯度鉴定的方法

权利要求书

1.用于鉴定甜瓜杂交种种子纯度的1对SSR引物，其特征在于包括上游引物序列：5’- GCACGAGGCTCAACTACC -3’， 下游引物序列： 5’- GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3’。

2.一种采用权利要求1所述引物，基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子鉴定纯度的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）采用权利要求1所述的上游引物序列：

5’- GCACGAGGCTCAACTACC -3’， 下游引物序列：

5’- GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3’引物对供试品种样品模板DNA进行PCR扩增，其中的PCR扩增反应的总体积为10 μL，扩增反应体系为：2×GoTaq? Master Mixes 5 μL，上游和下游引物10μmol/L各0. 5μL，供试甜瓜杂交种基因组DNA模板，50 ng/μL，1μL，双蒸水补足10 μL；PCR反应程序为95℃预变性2 min，32个扩增循环，94℃ 45 sec，55℃ 45 sec，72℃ 45 sec；72℃延伸7 min，4℃保存；

（2）对PCR扩增产物进行凝胶电泳，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，凝胶组分为：去离子水21 mL，10×TBE 3 mL，40 % PAG 6 mL，TMED 30 μL，10% 过流酰胺 300 μL；设定电压 250 V，电泳 30 min，关闭电源，进行染色；染色过程：银染8～10 min，迅速水洗，NaOH显色数分钟，直至条带清晰即可，再次水洗；

（3）通过分析EST-SSR结果，比较杂交种及其双亲的特征谱带，对供试种子样品进行共显性互补带型分析，通过计算供试品种样品中杂交种数量占总样品数量的比例确定种子纯度。

3.权利要求2所述的基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子鉴定纯度的方法，其中所述的甜瓜指的是：西瓜、黄瓜。