[发明专利]一种基于EST-SSR标记的甜瓜杂交种种子纯度鉴定的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业的蔬菜育种与应用技术领域，涉及甜瓜杂交种纯度鉴定方法，更具体的是一种基于EST-SSR分子标记技术的杂交种种子纯度鉴定方法。

背景技术

种子是农业生产中最基本最关键的生产资料，其纯度的高低是直接衡量种子质量优劣的主要指标。种子纯度降低会显著降低作物的产量和产品品质，使农民蒙受巨大的经济损失。传统的种子纯度鉴定方法是以播种后植株的田间形态观察为依据，其周期长、工作量大，且易受环境、季节因素影响，导致结果存在偏差。因此，开发快速、准确的种子纯度鉴定方法已成为种子科研单位和企业共同关注的课题。

伴随着现代农业技术的不断发展，种子纯度鉴定技术由传统的形态标记鉴定逐步发展到集形态标记鉴定、生化标记鉴定和 DNA 分子标记鉴定为一体的综合鉴定技术体系。DNA分子标记是 DNA 在分子水平上遗传变异的直接反映，它们遗传性稳定，信息量大，不受内外环境的影响，而且具有与基因表达与否无关、检测迅速和操作简便等突出优点，因此，DNA 分子标记成为理想的快速鉴定种子纯度的检测方法之一，其中 RAPD、RFLP、AFLP、SSR 及ISSR 标记等在杂交种纯度鉴定中都有应用。

SSR 标记因其具有共显性、多态性高、实验程序简单等优点，是目前作物品种鉴定和种子纯度鉴定研究中最常用的标记之一。目前开发的 SSR 标记主要有基因组 SSR 和 EST-SSR 两类。相对于基因组SSR，EST-SSR充分利用现有的测序数据，省去了SSR引物开发过程中的文库构建和测序等步骤，降低了成本。近年来，随着测序技术的不断提高和分子生物学的深入研究，大量瓜类作物的EST被测序，迄今为止，国际葫芦科基因组计划研究小组共收录西瓜ESTs7856条，甜瓜126940条，黄瓜359105条。

EST 序列可从世界三大数据库EMBL（欧洲分子生物学实验室）、NCBI（美国国家生物技术信息中心）以及DDBJ（日本DNA数据库）获取，再利用相关软件即可设计得到SSR引物。EST序列中 SSR 的含量较高，而且在种属间具有良好的通用性。冯建明等对西瓜978条unigene序列分析，共检索出2136个EST-SSR，出现频率为53.4%，Kong等研究发现甜瓜EST序列每4.7kb出现一个SSR，22个EST-SSR引物对平均能揭示2.9个等位基因，平均期望杂合度0.442，有15对引物能在黄瓜上扩增出条带。关媛等从902 条黄瓜果实EST 检索出63 个SSR，设计了37 对引物，共有14 对引物在黄瓜和甜瓜之间有多态。胡建斌等从来源于NCBI数据库的6507条ESTs中检索到784个SSR。Kong 等利用来源于NCBI 的黄瓜EST 序列设计了54 对EST-SSR，分析了20 份黄瓜材料的遗传多样性，其中有13 对引物在甜瓜中扩增出了特异片段，7对引物检测出多态性。EST-SSR在葫芦科瓜类作物中的开发和应用尚处于起始阶段，由于来源于西瓜、甜瓜和黄瓜中的EST数量有限，造成可以利用的SSR偏少。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种基于EST-SSR分子标记技术的甜瓜杂交种种子纯度鉴定方法，为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

本方法通过对供试甜瓜杂交种进行DNA提取、PCR扩增和EST-SSR分析，确认了杂交种及其双亲稳定的共显性互补带型，从而对甜瓜杂交种进行纯度鉴定。用于鉴定甜瓜杂交种种子纯度的SSR引物，包括引物正向序列：5’- GCACGAGGCTCAACTACC -3’，反向引物序列：5’- GAGACCGAAATTGAAGAATAG -3’。

本发明所述快速鉴定甜瓜杂交种种子纯度的方法，该方法以温室甜瓜品种绿天使供试种子（天津科润蔬菜研究所）的基因组DNA为模板，对已知品种绿天使亲本DNA差异性片段进行分析。供试甜瓜杂交种取样及DNA提取方法为：对温室甜瓜（来自天津科润蔬菜研究所）随机取样，总共50株，取靠近根部的嫩叶部分50～100 mg，液氮冷冻研磨（Retsch MM400生物粉碎仪），加入CTAB裂解缓冲液（20 g/L CTAB，1.4 M NaCl，0.1 M Tris-HCl，20 mM Na2EDTA）500μL，65℃恒温水浴（Neslab）裂解30min，后续DNA提取纯化按树脂型基因组DNA提纯试剂盒（赛百盛）操作进行。DNA提取后浓度统一稀释至50±1 ng/μL，Nanodrop ND1000，Thermol）。DNA提取方法也可以按市售试剂盒进行。

供试甜瓜杂交种PCR方法为：

(1) SSR上游引物序列：