[发明专利]一种新的酯酶及其编码基因和应用

说明书

技术领域：

本发明属于基因工程和生物催化技术领域，具体涉及一种来自印度洋深海芽孢杆菌属的酯酶基因，该基因表达的酯酶，以及该酯酶可以用于异丁酸乙酯的生物制造。

背景技术：

异丁酸乙酯作为《食品添加剂使用标准》规定允许使用的食用香料，主要用于配制奶油及草莓、樱桃等所有水果型香精，也可用于香烟、日化产品或其它产品的香原料，同时也是一种优良的有机溶剂。工业上生产异丁酸乙酯的方法主要是使异丁酸和乙醇直接酯化，一直沿用强酸(如浓硫酸、对甲苯磺酸等)作催化剂。尽管强酸作为酯化合成催化剂具有理想的催化活性且价格低廉，但强酸易使有机物碳化和氧化，且具有选择性差、产品色泽深、能耗高、副反应多、对设备腐蚀严重和污染环境等缺点。因此，国内外都在探索代替强酸的新型催化剂，其中生物催化剂(酶)是人们最为关注的类型之一。酶在工业生产中具有很大的优势，能在常温常压下反应，反应速率快，催化作用专一，无污染，价格较低等。

酯酶(Esterase)是一种能催化酯键水解和合成的酶的总称，在催化酯键水解时产生甘油和脂肪酸；在催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应时则产生酯类等香味物质。酯酶广泛的存在于动物、植物和微生物中，其中动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。目前酯酶已经被广泛的应用于食品酿造、农业、医药化学、制浆造纸工业、污水处理和生物修复等领域。另一方面，酯酶不仅在异相系统(油-水界面)中发生作用，而且有些酯酶在有机相中也能起催化作用，被广泛应用于酯类合成。目前，在有机介质中酯酶催化相应的酸和醇合成辛酸乙酯、丁酸乙酯、丁酸丁酯和戊酸乙酯已有相关的报道。在食品加工方面，固定化的酯酶现在已被用于芳香酯的合成，比如利用酯酶制备的呈天然水果味的低分子量芳香酯。

目前有关异丁酸乙酯的合成报道主要涉及传统的强酸催化法，对生物催化法暂未见报道。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种来源于印度洋深海的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO15121的新的酯酶。

本发明的新的酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种编码上述酯酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供上述酯酶在催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应产生酯类中的应用。

优选，是催化乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、庚酸分别与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇合成相应的脂类中的应用。

在合成反应体系中，所述的乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸或庚酸，与乙醇、丙醇、丁醇、戊醇或己醇的物质的量之比为1:1.5，所述的底物酸的浓度为200mM，合成反应温度为30℃，酯酶EST04211的使用量为30g/L的条件下，合成相应的短链芳香酯类香料，酯化率大部分达到85％～95％。

进一步优选，是催化异丁酸和乙醇合成异丁酸乙酯中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种异丁酸乙酯的合成方法，其特征在于，以上述酯酶为催化酶，以异丁酸和乙醇作为底物，以正己烷为介质，催化生成异丁酸乙酯。

在反应体系中，所述的异丁酸和乙醇的最佳物质的量之比为1:1.5，所述的底物异丁酸的最适浓度为200mM，合成反应最适温度为30℃，酯酶的最佳使用量为30g/L。

本发明的酯酶EST04211，水解活性最高的底物为对硝基苯基丁酸酯(p-NP C4)，其次为对硝基苯基己酸酯(p-NP C6)与对硝基苯基乙酸酯(p-NP C2)。反应的最适pH值为8.0，在pH＝8.0～10.0之间具有较高的水解活性。反应的最适温度为40℃，30～55℃之间保留有较高的水解活性。

本发明的酯酶EST04211经冷冻干燥制成酶粉后，在有机介质中可应用于异丁酸乙酯的合成，合成反应以正己烷为介质；底物异丁酸和乙醇的最佳摩尔比为1:1.5；在确定底物摩尔比后，底物异丁酸的最适浓度为200mM；合成反应的最适温度为30℃；合成反应中催化剂EST04211的最佳使用量为30g/L；在最适合成条件下，获得的最高酯化率为97％，初始合成速率为31mmol L^-1h^-1。