[发明专利]生物工程菌株及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种制备生物工程菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，分别利用第一引物和第二引物进行第一PCR扩增获得第一扩增产物，利用第三引物和第四引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物，其中，所述第一扩增产物具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述第二扩增产物具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

2)利用重叠基因扩增技术，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理，以便获得连接产物，所述连接产物具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；

3)将所述连接产物经EcoRI和PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组质粒pK18DU1；

4)将所述重组质粒导入E.coli S17-1，以便获得重组大肠杆菌菌株；

5)将所述重组大肠杆菌菌株与所述假单胞菌株M18G进行双亲杂交交换，以便获得假单胞菌株M18GU；

6)将携带phzH基因的重组表达质粒pBBRphzH转入所述假单胞菌株M18GU，以便获得携带phzH基因的重组表达质粒的生物工程菌株M18GU/pBBRphzH。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一引物和第二引物分别具有SEQ ID NO：2-3所示的核苷酸序列，所述第三引物和第四引物分别具有SEQ ID NO：4-5所示核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理，进一步包括：

将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物混合，并利用DNA聚合酶LA Taq进行第三PCR扩增，以便获得第三扩增产物；

利用第一引物和第四引物进行第四PCR扩增，以便获得第四扩增产物；

将所述第四扩增产物进行纯化回收，以便获得所述连接产物。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第三PCR扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，10个循环；72℃1min，

所述第四PCR扩增的反应程序为：95℃3min；95℃30s，50℃1min，72℃1min，25个循环；72℃1min。

5.一种生物工程菌株，其是由权利要求1-4任一项所述的方法制备获得的。

6.权利要求5所述的生物工程菌株在制备吩嗪-1-甲酰胺中的用途。

7.一种制备吩嗪-1-甲酰胺的方法，其特征在于，包括以下步骤：

将权利要求5所述的生物工程菌株进行活化，其中，所述生物工程菌株是通过权利要求1-4任一项所述的方法制备获得的；以及

将活化的生物工程菌株进行种子扩大培养，以便获得吩嗪-1-甲酰胺。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述活化进一步包括：

将所述生物工程菌株接种于甘油培养基平板，在26-30℃下，活化生长20-24小时；以及

在所述甘油培养基平板上划菌块，于26-30℃下活化10-12小时，

其中，所述甘油培养基中各组分的重量百分比为：蛋白胨1.8-2.2％，甘油1.3-1.7％、硫酸镁0.05-0.10％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、琼脂1.2-1.5％、余量为水，pH6.8-7.2。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述种子扩大培养进一步包括：

将所述活化的生物工程菌株，转接到含有25毫升甘油培养液、体积为250毫升的三角瓶中，在26-28℃的摇床中振荡培养11小时，摇床转速为160-180转/分；以及

然后，转接到含有65毫升的产素培养液、体积为500毫升的三角瓶中，进行放大发酵培养，温度和转速不变，发酵时间为72小时，

其中，所述甘油培养液中各组分的重量百分比为：蛋白胨1.8-2.2％、甘油1.3-1.7％、硫酸镁0.05-0.10％、磷酸二氢钾0.01-0.05％、余量为水，pH6.8-7.2，

所述产素培养液中各组分的重量百分比为：黄豆粉6.5-8.0％、玉米浆1.0-2.0％、甘油1.0-2.0％、葡萄糖0.5-1.5％、硝酸钾0.8-1.8％、余量为水，pH7.5-8.0。