[发明专利]生物工程菌株及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于微生物源农药生产技术领域，尤其涉及一种改进的用于生产新型微生物源杀菌剂的工程菌株的制备及其应用。具体地，本发明涉及制备生物工程菌株的方法、生物工程菌株在制备吩嗪-1羧酸中的用途以及制备吩嗪-1-甲酰胺的方法。

背景技术

假单胞菌生物合成的吩嗪-1-羧酸，是一种重要的抗真菌物质。吩嗪-1-羧酸化学结构中的1位羧酸基团的解离状态，与其抗菌活性的强弱密切关系。吩嗪-1-羧酸化学结构中的1位羧酸基团经酰胺化，衍生为吩嗪-1-甲酰胺，与吩嗪-1-羧酸相比，其抗菌活性不受使用条件的酸度值影响，从而能稳定其抗菌活性，能更加有效地防治作物病害。同时，吩嗪-1-甲酰胺与吩嗪-1-羧酸相比，对小鼠的急性经口毒性下降一个数量级，是一种更为安全的生物杀菌剂。长期以来，由于假单胞菌合成吩嗪-1-甲酰胺的效率较低，生产成本太高，难以实现工业化生产。前不久，我们利用生产吩嗪-1-羧酸的假单胞菌株M18及其衍生的工程菌株M18G为宿主，携带能表达phzH基因、编码产生谷酰胺吩嗪-1-羧酸酰胺转移酶(glutamine phenazine-1-carboxylic acid amidotransferase，PhzH)的重组表达质粒pBBRphzH，在宿主中补充并添加phzH基因的拷贝数，并在宿主中进行表达，将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-酰胺(具体可参见专利申请：CN201110054035.X；PCT/CN2011/082531)。但是，该技术所使用的出发菌株为生产吩嗪-1-羧酸的野生型菌株M18及其衍生的工程菌株M18G。在野生型菌株M18中，发酵生产吩嗪-1-羧酸的产量仅为每升200毫克左右；在M18衍生的工程菌株M18G中，其发酵效价也只能达到每升1500～1700毫克。由于，在野生型菌株M18和衍生菌株M18G中，作为吩嗪-1-甲酰胺前体的吩嗪-1-羧酸产量相对地都比较低，在优化的培养基中，吩嗪-1-甲酰胺的发酵效价只能达到每升2500～2800毫克，生产成本仍然比较高，难以在农业生产中大规模推广应。

因而，目前的生产吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株仍有待改进。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的缺陷，提供一种改进的用于高效生产微生物源杀菌剂吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株及其制备方法和应用。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备生物工程菌株的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

1)以假单胞菌株M18G基因组DNA为模板，分别利用第一引物和第二引物进行第一PCR扩增获得第一扩增产物，利用第三引物和第四引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物，其中，所述第一扩增产物具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，所述第二扩增产物具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；

2)利用重叠基因扩增技术，将所述第一扩增产物和所述第二扩增产物进行连接处理，以便获得连接产物，所述连接产物具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；

3)将所述连接产物经EcoRI和PstI酶切后，插入质粒pK18mobsacB中，形成重组质粒pK18DU1；

4)将所述重组质粒导入E.coli S17-1，以便获得重组大肠杆菌菌株；

5)将所述重组大肠杆菌菌株与所述假单胞菌株M18G进行双亲杂交交换，以便获得假单胞菌株M18GU；

6)将携带phzH基因的重组表达质粒pBBRphzH转入所述假单胞菌株M18GU，以便获得携带phzH基因的重组表达质粒的生物工程菌株M18GU/pBBRphzH。

需要说明的是，本发明的制备生物工程菌株的方法，通过定向缺失M18衍生菌株M18G的基因组中吩嗪-1-羧酸合成基因簇(phz1)上游的5’-非编码区，构建成基因突变菌株M18GU，去除对吩嗪-1-羧酸合成基因簇phz1表达的抑制作用，从而M18GU菌株合成吩嗪-1-羧酸的效率大大提高；然后将phzH基因重组表达质粒转化入M18GU菌株，以便获得能够高效生产吩嗪-1-甲酰胺的生物工程菌株，实现phzH基因的高效表达，并将吩嗪-1-羧酸转化为吩嗪-1-甲酰胺，从而能够高效地生产吩嗪-1-甲酰胺。发明人发现，本发明的制备生物工程菌株的方法，操作简单、适于大规模生产，并且制备获得的生物工程菌株能够有效用于吩嗪-1-甲酰胺的生产，且生产效率高，发酵效价稳定，不需要异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的诱导，生产成本低，适宜于大规模生产。