[发明专利]一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法

说明书

本发明公开了一种悬浮培养BHK‑21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法，发明通过对培养基中氨基酸、无机盐、维生素、脂类、水解物和其余添加物的添加和组分优化，显著促进了细胞的增殖速度，缩短了倍增时间，使细胞达到更高生长密度的同时保持较高的活力。该培养基是适合BHK‑21细胞高密度悬浮培养的低成本无血清无动物源低蛋白培养基，通过脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等成分的添加完全替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使得BHK‑21细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。

技术领域

本发明涉及生物制药技术领域，具体涉及一种悬浮培养BHK-21细胞的无血清无动物源培养基及其配制方法。

背景技术

BHK-21细胞系即叙利亚仓鼠肾细胞，英文名称:Baby Hamster Kidney Cell，1961年英国人I.A.Macpherson和M.G.P Stocker用1日龄叙利亚仓鼠的肾建立的传代细胞，常用的是克隆13，是由5只一日龄，性别特征不是特别明显的肾细胞而来，即：BHK-21C13，中文全名为：叙利亚仓鼠肾细胞克隆13，以下简称BHK-21细胞。BHK-21细胞是世界卫生组织和中国生物制品规程认可的生产疫苗的细胞系，可以用于多种病毒的增殖和纯化，如口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus，FMDV)，脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)，呼肠孤病毒(Reovirus)，水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)等。由于它生长速度较快、病毒敏感谱广、对大量制备病毒疫苗有利，研究人员经无数次传代驯化，使它可悬浮生长并用于病毒性疫苗的生产，如口蹄疫疫苗，狂犬病疫苗，乙脑疫苗等。

目前采用BHK-21细胞的疫苗生产中，无血清悬浮培养是最为先进的工艺。无血清培养基相比有血清培养基具有诸多优势：1)可克服血清批次间的差异性，使细胞培养性能更加稳定，能提高结果的重复性；2)可避免血清的外源性污染，因为动物来源血清常携带病毒或支原体；3)可简化下游目的产物的分离纯化，节省成本；4)成分相对明确，有利于研究细胞生长、增殖、分化、代谢及基因调控等一系列细胞行为。

目前，国外的无血清培养基产品价格高且配方保密，同时国内外均缺少专门针对BHK细胞培养的无血清培养基，而且培养基性能较差，例如中国内2014年公布的最新专利CN103555658A，其发明的BHK-21无血清悬浮培养基，以50*10⁴cells/ml接种，24小时后仅能达到150*10⁴cells/ml，细胞增殖速度缓慢，倍增时间较长，96小时后仅能达到500*10⁴cells/ml，所能支持细胞生长的密度较低。中国内的培养基龙头企业北京清大天一生物技术有限公司开发出可以悬浮培养BHK细胞的低血清培养基，根据其细胞手册2011版显示，即使清大天一生物技术有限公司的低血清培养基，悬浮培养BHK-21细胞的密度也仅仅达到了400*10⁴cells/ml。综上所述，开发低成本、支持细胞快速增殖和高密度悬浮培养的BHK-21细胞无血清培养基对国内动物疫苗行业的发展具有重要意义。

发明内容

本发明目的在于，克服现有技术中的缺陷，提供一种针对中国工业生产所用BHK-21细胞的生长的特点，研制适合BHK-21细胞高密度悬浮培养的低成本无血清无动物源低蛋白培养基。通过添加脂类、维生素、微量元素、重组蛋白和水解物等组分来替代血清的生物学功能，避免了血清对后期纯化和抗原的分离带来的一些负面作用。通过对培养基组分的优化，使BHK-21细胞在悬浮培养中增殖速度更快，细胞密度更高，细胞活力更强，更适合于规模化工业生产。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案是：提供一种促进悬浮培养BHK-21细胞快速增殖的无血清无动物源培养基，其特征在于：包括氨基酸，无机盐，维生素，蛋白水解物，脂类和添加物；