[发明专利]基于核酸序列的蛋白质相互作用检测方法

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质研究技术领域，具体涉及蛋白质相互作用的检测，尤其涉及利用DNA编码蛋白质相互作用信息进行蛋白质相互作用的在体检测方法，试剂盒及其用途。

背景技术

传统在体蛋白质间相互作用检测技术尽管已被广泛应用于生物学研究，但存在诸多不足。例如，酵母双杂交技术(Y2H)虽然实现简单，但是其动态检测和定量检测能力明显不足，而荧光共振能量转移技术(FRET)虽然有较好的时空分辨率以及定量能力，但其受限于荧光蛋白的荧光强度以及蛋白质的空间结构等性质。并且，这些传统检测技术仅能针对单一蛋白质相互作用对进行检测，不能在同一个细胞内对包含有多对相互作用的蛋白质相互作用网络进行同时检测。

为此，我们通过发明蛋白质二聚化足迹法(Protein Dimerization footprinting，简称PDf)检测技术，将基于核酸序列的检测技术与蛋白质间相互作用检测相结合，从而实现在体地、定性和/或定量地、动态地检测蛋白质相互作用，并使直接对蛋白质相互作用网络进行检测成为可能。

发明内容

本方法利用目的蛋白质间相互作用强度对与其融合的DNA结合结构域与相应特异性DNA结合位点间结合动力学的改变，来实现将目的蛋白质间相互作用由相应特异性DNA序列表示，而目的蛋白质间相互作用强度则由该序列的拷贝数给出。

具体的，本发明涉及以下各项：

1.获取蛋白质间相互作用信息的方法，其包括如下步骤：

(1)在宿主细胞中表达融合有DNA结合结构域的目的蛋白质，所述DNA结合结构域二聚化时对相应特异性DNA序列的亲和力显著高于单体时；

(2)在生理状态下用交联剂处理，将宿主细胞中的目的蛋白质二聚体和DNA交联形成复合体；

(3)将DNA打碎成小片段；

(4)分离提取所述小片段，并用DNase I消化；

(5)使用去交联剂处理，将步骤(4)的产物去交联，并纯化得到DNA片段；

(6)检测步骤(5)得到的DNA片段。

2.根据1所述的方法，所述宿主细胞包括大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞。

3.根据1所述的方法，所述DNA结合结构域包括λ噬菌体蛋白质CI的DNA结合结构域及其符合权利要求1步骤(1)中所述DNA结合结构域性质的突变体，λ噬菌体蛋白质CRO的DNA结合结构域及其符合权利要求1步骤(1)中所述DNA结合结构域性质的突变体；所述相应特异性DNA序列包括CI结合序列及它们的突变序列，CRO结合序列及它们的突变序列。

4.根据1所述的方法，所述步骤(2)中使用的交联剂为甲醛。

5.根据1所述的方法，所述步骤(3)中使用MNase或者超声处理打碎DNA为小片段。

6.根据1所述的方法，所述步骤(5)中使用的去交联剂为蛋白酶K。

7.根据1所述的方法，所述步骤(6)中的检测包括基于核酸序列的定性和/或定量检测，所述定量检测包括定量PCR、高通量测序和/或DNA微阵列，所述定性检测包括PCR和/或琼脂糖凝胶电泳。

8.一种用于获取蛋白质相互作用信息的试剂盒，包括：

(1)带有DNA结合结构域和相应特异性DNA序列的表达载体，所述DNA结合结构域二聚化时对相应特异性DNA序列的亲和力显著高于单体时；

(2)宿主细胞；

(3)交联剂及其反应终止液；

(4)打碎DNA的装置或试剂及其反应缓冲液；

(5)DNase I及其反应缓冲液；

(6)去交联剂；

(7)DNA检测装置。

9.根据8所述的试剂盒，所述交联剂为甲醛，所述交联反应终止液为甘氨酸溶液，所述去交联剂为蛋白酶K，所述打碎DNA的试剂为MNase。

10.根据8所述的试剂盒，所述DNA检测装置包括定性和/或定量检测装置，所述定量检测装置包括定量PCR装置、高通量测序装置或DNA微阵列检测装置，所述定性检测装置包括PCR装置或琼脂糖凝胶电泳装置。