[发明专利]一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及到一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法。

背景技术

双分子荧光互补技术是一种直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用的技术，该技术巧妙地将荧光蛋白分子的两个互补片段分别与目标蛋白融合表达。如果荧光蛋白活性恢复，则表明两目标蛋白发生了相互作用，其后发展出的多色荧光互补技术不仅能检测到同时多种蛋白质复合体的形成，还能对不同蛋白间产生相互作用的强弱进行比较，目前该技术已用于转录因子，不同蛋白间产生相互作用强弱的比较以及蛋白质泛素化等方面的研究工作。

适配体技术是指利用筛选的适配子对靶标进行定位、检测和功能生物学研究的技术。适配子包含DNA适配子、 RNA适配子和肽适配子三大类。它们能特异地结合包含离子、DNA、RNA、蛋白、糖分子等在内的靶物质，甚至是完整的细菌和细胞。与抗体相比，适配子具有长的半衰期、无毒且可以通过无免疫原性的靶分子筛选获得的特性，而且它们也可以很容易地通过化学合成或表达系统产生。现在，筛选DNA或RNA适配子主要是通过指数富集的配基系统进化技术(Selex)完成，而经典的肽适配子的筛选主要利用酵母双杂交技术从随机肽表达文库中筛选获得。为了稳定源自于随机表达文库的肽适配子的构象，通常是将一系列编码肽适配子的可变阅读框架插入至一个支架蛋白框架（通常是细菌的硫氧还蛋白）以形成融合蛋白，借此，融合的肽适配子能形成特定的蛋白构象以利于适配子和靶分子之间的相互结合。

肽适配子是指从随机表达文库中筛选针对蛋白质靶标的短肽，这些从高容量的文库中筛选获取的短肽能特异与靶标结合，从而影响靶标的功能，可应用于靶标及其复合物功能的干扰研究。

发明内容

本发明的目的是提供一个利用双分子荧光互补技术快速从高容量的随机表达肽适配子文库中筛选鉴定针对靶标的特异肽适配子方法。

本发明提供了一个高容量的随机肽适配子表达文库，该文库通过双分子荧光互补技术筛选靶标的肽适配子。

一种基于双分子荧光互补技术的肽适配子文库构建方法，包括以下步骤：

1）根据实验设计，合成包含TrxA-MCS-TrxA的核苷酸序列；

2）应用设计引物，以合成的TrxA-MCS-TrxA为模板，对合成序列进行高保真PCR扩增；

3）利用酶切连接方法将TrxA-MCS-TrxA转移入载体pBiFc-VC155双荧光互补表达表达载体，获得载体pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA；

4）设计11个氨基酸的随机对应核苷酸序列，并通过酶切连接方法，插入pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA载体的多克隆位点中；转化细菌后，抽提质粒进行测序确认获得肽适配子文库pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA。

所述的文库质粒pBiFc-VC155-TrxA-11aa-TrxA包含随机的11个氨基酸及其多种组合排列，且随机的氨基酸被固定于细菌硫氧还蛋白TrxA的支架中，具有稳定的构象，且该表达片段和VENUS蛋白C155片段融合表达。

将连接获取的载体转化感受态细胞，并涂布于氨苄青霉素抗性LB平板。

对平板上的克隆进行摇菌，并提取质粒，通过酶切和菌液PCR对克隆进行鉴定。将阳性克隆送生物技术服务公司进行测序和分析。

所述的方法构建获得的肽适配子文库。

该文库能够表达11个随机氨基酸，且这些随机氨基酸通过TrxA蛋白支架形成稳定的构象，所述出发载体为pBiFc-VC155。

该文库用于蛋白分子靶标的筛选，设计将另外一个靶标X和双分子荧光互补载体pBiFc-VN173进行融合表达，并获得pBiFc-VN173-X载体。

将文库质粒和pBiFc-VN173-X质粒分别用去内毒素质粒抽提试剂盒进行抽提后测浓度，并将pBiFc-VN173-X和单个肽适配子表达质粒共转染HEK293T细胞，24-48小时后观察荧光的出现以确定获得的特异结合肽适配子。

   具体方案为：

 设计并合成了具有32个随机核苷酸和1个固定核苷酸（对应于11个氨基酸）的核苷酸片段，并携带相应的酶切位点。

    设计引物对包含随机核苷酸的DNA片段进行高保真PCR扩增，并通过酶切和载体构建方式将其定向插入于pBiFc-VC155-TrxA-MCS-TrxA载体的多克隆位点MCS中。