[发明专利]一种从血浆中吸附人凝血酶原复合物的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制品和血液制品生产技术领域，主要涉及血液制品生产中人凝血酶原复合物的固定床柱层析分离纯化方法。

背景技术

人凝血酶原复合物（Prothrombin Complex，PCC）是经由健康人血浆提取的，主要含有人凝血因子II、VII、IX、X 的血浆蛋白制品。中国药典要求该制品中人凝血因子IX效价不低于10IU/ml，其比活不小于0.5IU/ml。该产品主要用于治疗和预防由于II、VII、IX、X 因子缺乏引起的出血，如乙型血友病、肝病等。

PCC一般选用DEAESephadex A50凝胶生产，由于该凝胶溶胀系数在不同盐浓度下变化较大，国内外血液制品企业在实际生产中均采用批式吸附生产工艺，即将凝胶直接与反应罐中的血浆混匀，吸附完成后直接过滤出凝胶再进行洗涤和洗脱。批式吸附方法为开放式操作，操作繁琐，且有凝胶泄漏和交叉污染的风险。虽然也有相关的文献报道使用扩张床技术生产PCC，但是真正在生产中应用的案例未见报道，可见扩张床技术的大规模应用还不成熟。通用电气公司（GE）曾经专门开发了Streamline系列带有石英核心的凝胶品种专门用于扩张床技术，但是经过几年的推广发现实用性很差，现已基本被淘汰。

使用固定床层析技术直接从血浆中吸附PCC的生产工艺未见相关报道，其主要原因有以下两点：

第一、过滤澄清技术对血浆分离纯化工艺的限制。由于血浆成分复杂，除了含有血浆蛋白之外，还含有少量的血细胞或者碎片，脂肪或乳糜颗粒等不溶物，不溶物粒径大小不一，脂肪或乳糜还导致血浆具有较大的粘度。这些特性使大规模的血浆过滤澄清工艺很难实现。同时因为血浆中含有大量的凝血因子，带负电荷的过滤介质可能会给凝血因子提供激活表面，引起凝血反应，造成不可挽回的损失，对血液制品的生产造成巨大的影响。

第二、传统工艺中普遍使用的DEAESephadex A50凝胶，由于溶胀系数变化较大而不适合固定床层析工艺。

发明内容

本发明的目的在于使用固定床柱层析技术从血浆中吸附PCC，并经过洗涤和洗脱制备PCC。特别是在保证血浆凝血因子不被激活的前提下，实现了血浆的较大规模深层过滤和精细过滤，并筛选出适合吸附和分离纯化PCC的凝胶，直接用于固定床层析柱，用层析技术从血浆中直接吸附并纯化得到PCC，彻底解决传统批式吸附工艺容易引起污染，交叉污染，凝胶泄漏以及操作繁杂等问题。

本发明所采用的技术方案主要包括：（1）去除冷沉淀血浆；（2）血浆过滤，使血浆达到柱层析所要求的过滤精度和澄清度，并确保在过滤过程和过滤后血浆中的凝血因子不被激活或灭活；（3）固定床柱层析技术纯化PCC，用阴离子交换凝胶直接从血浆捕获PCC，使其他血浆蛋白从层析柱直接流穿，对层析柱进行洗涤和洗脱，从而获得纯化的PCC。具体的技术方案如下：

上述具体步骤为

（1）去除冷沉淀：

将新鲜冰冻人血浆在融化混匀后，经连续流离心机去除血浆中的冷沉淀，得到离心后的血浆上清液；

（2）血浆过滤

使用EDTA溶液对过滤材质进行清洗，再用枸橼酸钠溶液对过滤材质进行清洗，并洗去残留的EDTA，冲洗完成后排干设备内的溶液，用于血浆过滤，所采用的过滤材质为药用级别纤维素滤板；

（3）固定床柱层析分离纯化PCC

将凝胶装填在固定床层析柱内，柱床体积与上样的血浆量的比例为1:10~1:50，装填好的层析柱使用缓冲液A平衡2~5个柱体积，经过深层过滤后的血浆使用0.2μm的滤芯进行在线的膜过滤后泵入层析柱，上样流速为60~120cm/h，用缓冲液B洗涤层析柱，用缓冲液C洗脱层析柱，得到PCC制品，按照凝血因子IX的活性计算，PCC的收率可以达到75%~90%，比活性可以达到5.5IU/mg以上。

上述EDTA溶液的浓度为0.1%-10%，用量为100~300L/m²。

上述枸橼酸钠溶液的浓度为0.2%~10%，用量为100~300L/m²。

上述步骤（2）血浆过滤中，所述纤维素滤板的层数为单层或双层。

上述步骤（3）固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液A由25mmol/L枸橼酸钠和20mmol/L盐酸精氨酸组成，所述缓冲液的PH为7.0。

上述步骤（3）固定床柱层析分离纯化PCC中，所述缓冲液B由25mmol/L枸橼酸钠/20mmol/L盐酸精氨酸和0.1~0.4mol/L的NaCl组成。