[发明专利]一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒及其构建方法

权利要求书

1.一种受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，以重组腺病毒(Ad)为载体，根据不同类型肿瘤的遗传特点及转录水平，选择肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子进行调控腺病毒早期复制必需元件E1基因；及根据转录后水平选择肿瘤组织和正常组织差异表达的MicroRNA，设计多个拷贝的靶序列插入到腺病毒早期复制必需基因E1的3'非翻译区(3'UTR)，构建形成受转录和转录后水平双调控的溶瘤腺病毒；

所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒的构建方法，包括步骤：

1)通过PCR反应和克隆技术，分离肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子；

2)构建携带肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子调控腺病毒早期复制必需元件E1基因的腺病毒穿梭质粒；

3)设计MicroRNA靶序列的长度、拷贝数和连接序列，所述MicroRNA为miR-145，拷贝数为4个，4个拷贝miR-145靶序列的具体序列结构为gtt aac agg gat tcc tgg gaa aac tggact cag agg gat tcc tgg gaa aac tgg acc tga agg gat tcc tgg gaa aac tgg actagg agg gat tcc tgg gaa aac tgg acg tt；通过PCR反应或基因合成获得上述MicroRNA靶序列；

4)利用分子克隆技术将获得的MicroRNA靶序列插入到腺病毒早期复制必需基因E1表达框终止密码与polyA之间；

5)构建和鉴定携带报告基因及治疗基因的腺病毒骨架质粒；

6)包装、扩增、纯化腺病毒，并进行病毒滴度及功能鉴定；

7)病毒感染正常细胞及肿瘤细胞测定比较复制及杀伤能力，评价安全性及有效性；

所述的微环境特异性启动子选自低氧诱导性基因启动子或热休克蛋白基因启动子。

2.按权利要求1所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，构建的双调控溶瘤腺病毒使腺病毒的复制特异地局限在肿瘤细胞内，而在正常细胞内不复制。

3.按权利要求1所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述的腺病毒早期复制必需基因选自E1A，E1AE1B或E1AE1B19k。

4.按权利要求1所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述腺病毒早期复制必需基因的启动子，被人肿瘤细胞特异性启动子或微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子所替换；

所述的肿瘤细胞特异性启动子选自E2F1基因启动子，Midikin基因启动子或端粒酶(TERT)基因启动子；所述的肿瘤组织特异性启动子选自前列腺组织特异性抗原基因启动子，MUC1基因启动子，肺细胞表面蛋白基因启动子，α-甲胎蛋白(AFP)基因启动子，erbB2基因启动子，甲状腺球蛋白基因启动子，Tyrosinase基因的启动子，神经鞘基础蛋白基因启动子，乳球白蛋白基因启动子或癌胚抗原蛋白(CEA)基因启动子。

5.按权利要求1所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述腺病毒DNA的E3区域嵌入或不嵌入报告基因或抗癌基因。

6.按权利要求5所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒，其特征在于，所述抗癌基因选自：细胞凋亡诱导基因，抗新生血管形成基因，自杀基因，细菌毒素基因，肿瘤抑制基因，免疫调节因子和放射线增敏基因；其中，免疫调节因子选自：白介素(IL),各种集落刺激因子(CSF),肿瘤坏死因子(TNFα)或细胞粘附分子；自杀基因选自：细菌或及酵母的cytosine deaminase(CD)基因；疱疹病毒的thymidine kinase(TK)基因以及p450基因；

所述的抗癌基因的启动子包括：强效启动子、肿瘤细胞特异性启动子、微环境特异性启动子或肿瘤组织特异性启动子。

7.权利要求1所述的受转录和转录后双调控的溶瘤腺病毒在用于制备肿瘤基因治疗药物中的用途，所述肿瘤为非小细胞肺癌。