[发明专利]一种用于预防弓形虫病的多价腺病毒疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于预防弓形虫病的腺病毒疫苗，具体的,涉及一种基于弓形虫速殖子、缓殖子及子孢子多个生活史时期的保护性抗原片段连接组成的弓形虫多抗原复合基因，并以泛素蛋白基因作为佐剂，构建重组腺病毒作为载体的弓形虫多价腺病毒疫苗。 

背景技术

弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界性分布的寄生原虫，广泛寄生于人体及动物的有核细胞内，引起严重的人兽共患寄生虫病。我国一般人群对弓形虫普遍易感，平均感染率约为7.89％，对于特殊人群(如孕妇)其感染率可高达10％以上。孕早期妇女感染后，可导致流产、早产甚至死产，幸存者也常遗留严重的新生儿畸形和胎儿眼部并发症。对于免疫力缺乏或者低下的人群(如艾滋病和肿瘤患者)，弓形虫可导致严重的临床症状(如弓形虫脑病)甚至死亡。不仅如此，在免疫功能正常的宿主体内，往往形成慢性感染，引起不可逆的中枢神经系统和视力的损害。因此，弓形虫病防治刻不容缓！而研究安全、有效的疫苗被认为是弓形虫病防控的重要策略。 

人类感染弓形虫是由于猫粪内的卵囊或动物肉类中的包囊或假包囊被中间宿主如人、羊、猪、牛等吞食后，在肠内逸出子孢子、缓殖子或速殖子，随即侵入肠壁经血或淋巴进入单核巨噬细胞系统的细胞内寄生，并扩散到全身各组织器官，如脑、淋巴结、肝、心、肺、肌肉等进入细胞内并发育增殖，引起弓形虫病。因此，弓形虫的速殖子，缓殖子和子孢子时期都是重要的致病时期。腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达及体外基因转导、体内接种疫苗、和基因治疗等各个领域,且宿主范围广,不整合到染色体中，无插入致突变性，对人致病性低，安全性高，且能同时表达多个基因,及易激发机体产生更全面体液免疫和细胞免疫应答，特别是可以携带特异性抗原基因进入细胞，对胞内寄生的寄生原虫具有很强地杀伤作用。但只针对某一时期的抗原的疫苗难以形成全面有效的保护性。我们研制用腺病毒载体携带的含有弓形虫多个时期的复合多价抗原基因疫苗对非常必要的。 

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种用于预防弓形虫病的复合多价抗原基因。 

本发明的第二个目的是提供一种重组质粒，其包括腺病毒载体和复合多价抗原基因。 

本发明的第三个目的是提供一种用于预防弓形虫病的腺病毒疫苗。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种用于预防弓形虫病的复合多价抗原基因，将泛素蛋白基因与弓形虫速殖子抗原基因SAG3_101-144,ROP18_347-396,MIC6_288-347,GRA7_182-224，缓殖子抗原基因MAG1_58-125,BAG1_156-211以及子孢子抗原SPA基因，AS15基因连接起来，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 

一种重组质粒，由上述的复合多价抗原基因插入到腺病毒载体pHBAd-MCMV-GFP上，即得重组质粒pHBAd-MCMV-GFP-UbTg.MEG。 

一种用于预防弓形虫病的腺病毒疫苗，由上述的重组质粒与骨架质粒pHBAd-BHG共同转染入293细胞中包装出病毒颗粒，即获得重组腺病毒疫苗Ad-UbTg.MEG。 

该预防弓形虫病的腺病毒疫苗的制备方法，包括以下步骤： 

(1)从弓形虫速殖子抗原SAG3,ROP18,MIC6,GRA7，缓殖子抗原MAG1,BAG1以及子孢子抗原SPA基因中筛选出抗原表位集中的区域，SAG3_101-144,ROP18_347-396,MIC6_288-347,GRA7_182-224,MAG1_58-125,BAG1_156-211,SPA_142-200以及AS15,构成线型复合多价抗原基因，并在其N端链接泛素蛋白基因，合成用于预防弓形虫病的复合多价抗原基因； 

(2)将合成的目的基因经双酶切后插入载体pHBAd-MCMV-GFP的BamHⅠ和SmaI位点间,产生pHBAd-MCMV-GFP-UbTg.MEG重组质粒；重组质粒经酶切，PCR和测序鉴定后，提取质粒并纯化，将该重组质粒与骨架质粒pHBAd-BHG共同转染入293细胞中包装出毒，获得重组腺病毒疫苗。