[发明专利]香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用

权利要求书

1.一种香樟低温诱导CBF-like转录因子，其特征在于，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a(CcCBFa基因)和香樟低温诱导CBF-like转录因子b(CcCBFb基因)，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的编码蛋白，其特征在于，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、香樟总RNA的提取；采用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取香樟总RNA，所提RNA加入30-50ul DEPC处理水，充分溶解后于-80℃保存；

步骤2、反转录PCR；

步骤3、香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；

其中，香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆的反应条件为：

UPM＝UPL(10uM)2ul+UPS(10uM)10ul+ddH₂O38ul

a).反应体系为50ul：

b).反应条件：

94℃预变性4min；5个循环；30个循环；72℃总延伸10min；

分别取上述PCR产物1ul溶于49ulddH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板(Template)；

c).3’/5’RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50ul：

d).巢式PCR反应条件：

94℃预变性4min；35个循环；72℃总延伸10min；

步骤4、PCR产物的胶回收，具体为：琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收；

步骤5、PCR产物的克隆，A-T克隆；

步骤5.1、回收的目的产物与TaKaRa公司生产的pMD19-TVector16℃连接过夜，反应体系如下：

步骤5.2、大肠杆菌感受态细胞的转化

将上述连接产物加于50ul Trans5α大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴5min，缓慢加入400ul新鲜液体LB，37℃，180rpm50min，吸取100ul菌液涂于添加有Amp100mg/L的LB平板上，置于37℃恒温培养箱中，倒置过夜培养12-16h；

步骤6、阳性重组子的筛选及鉴定；随机挑取上述转化平板中的阳性菌以pMD19-T载体通用引物M13上、下游引物进行菌落PCR，将PCR扩增产物置于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，将检测正确的阳性菌接种于1ml添加有Amp100mg/L的液体LB中摇菌培养，送往生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果进行拼接，从而获得2个香樟CBF-like基因的全长cDNA(CcCBFa和CcCBFb)序列，其核苷酸序列分别为：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

步骤7、对步骤6中的香樟低温诱导CBF-like转录因子a和香樟低温诱导CBF-like转录因子b使用DNAman分子软件分析，得香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白序列和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白序列，其氨基酸序列分别为：SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。