[发明专利]香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学及园林植物育种技术领域，具体涉及一种香樟低温诱导CBF-like转录因子及其编码蛋白、克隆方法和应用。

背景技术

樟树又名香樟、乌樟，樟科樟属Cinnamomum camphora L.；其树冠广展，浓荫遍地，气势雄伟，是优良的行道树及庭荫树；香樟在我国的分布大体以长江以北为界，南至两广及西南，以江西，浙江、福建等东南沿海省份为多，因而在栽培范围上受到低温的限制。近年来，为丰富北方园林的树种组合，改善冬季园林植物景观，香樟被引种栽植到黄河流域的一些省分。然而北方漫长而寒冷冬季往往导致香樟生长受损，严重时甚至树体死亡，造成巨大的经济损失。因此，防治冻害就成为这一优良树种在北方城市顺利推广及应用的一个亟待解决的问题，解决这一问题的主要方法可采取加强栽培管理和选育抗寒新品种，而后者是根本途径，但目前没有相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供香樟低温诱导CBF-like转录因子，具体涉及2个香樟抗逆相关的低温诱导CBF-like转录因子a(GenBank登录号为KJ958932)和b(GenBank登录号为KJ958933)(Cinnnamomum camphora CBF-like transcription factor,CcCBFa and CcCBFb)基因核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。为进一步研究香樟CBF-like基因的功能，以及CBF基因改良作物抗逆性，特别是改良抗寒性的应用奠定良好的基础。

本发明的另一目的是提供一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的编码蛋白。

本发明的另一目的是提供一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法。

本发明的另一目的是提供一种上述的香樟低温诱导CBF-like转录因子在创建改良抗逆性植物基因工程株系中的应用。

本发明所采用的第一技术方案是，一种香樟低温诱导CBF-like转录因子，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a(CcCBFa基因)和香樟低温诱导CBF-like转录因子b(CcCBFb基因)，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所采用的第二技术方案是，一种香樟低温诱导CBF-like转录因子编码蛋白，包括香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白和香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子a编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述香樟低温诱导CBF-like转录因子b编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明所采用的第三技术方案是，一种香樟低温诱导CBF-like转录因子的克隆方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、香樟总RNA的提取；采用EASY spin Plus植物RNA快速提取试剂盒提取香樟总RNA，所提RNA加入30-50ul DEPC处理水，充分溶解后于-80℃保存；

步骤2、反转录PCR；

步骤3、香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆，并用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；

其中，香樟CBF基因的3’/5’RACE克隆的反应条件为：

UPM＝UPL(10uM)2ul+UPS(10uM)10ul+ddH₂O38ul

a).反应体系为50ul：

b).反应条件：

94℃预变性4min；5个循环；30个循环；72℃总延伸10min。

分别取上述PCR产物1ul溶于49ul ddH2O中，充分溶解混匀，做巢式PCR的模板(Template)。

c).3’/5’RACE的巢式PCR扩增，反应体系为50ul：

d).巢式PCR反应条件：

94℃预变性4min；35个循环；72℃总延伸10min；

步骤4、PCR产物的胶回收，具体为：琼脂糖凝胶电泳结束后，紫外灯下切下目的条带，用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒进行回收；

步骤5、PCR产物的克隆，A-T克隆；