[发明专利]干细胞的产生和保持

说明书

本申请是国际申请号PCT/US2009/068274，国际申请日为2009年12月16日，中国国家申请号为200980156917.8，发明名称为“干细胞的产生和保持”的分案申请。

发明背景

尽管从1981年就已经由小鼠建立了胚胎干细胞(ESCs)，但是由各种其它哺乳动物(包括大鼠)衍生它们的对应体的尝试尚未成功。近来，从小鼠和大鼠的植入后卵圆柱期上胚层衍生了多能干细胞(Brons等，Nature(自然)448，191-195(2007)；Tesar等，Nature(自然)448，196-199(2007))。这些新型的干细胞被命名为上胚层干细胞(EpiSCs)。在群落形态和对保持多能性的培养/信号传导需要方面，EpiSCs似乎非常接近地对应于人胚胎干细胞(hESCs)，但是表现出一定范围的与小鼠ES细胞(mESCs)不同的显著的表型和信号传导反应差异。

白血病抑制因子(LIF)是在存在血清的条件下通过JAK-STAT3途径保持mESCs多能性所必需的(Niwa等，Genes Dev(基因发育)12，2048-2060(1998))。然而，在不含血清的培养基中，还需要BMP4，以及LIF，以通过诱导分化(Id)蛋白表达的抑制剂(Ying等，Cell(细胞)115，281-292(2003))和抑制ERK激活(Qi等，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)101，6027-6032(2005))来保持mESC的自我更新。与mESCs相反，LIF不能支持EpiSCs/hESCs，其典型地需要碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)/激活蛋白A(Activin A)进行长期的自我更新。未分化的hESCs通过bFGF信号传导表现出高水平的基本ERK活性(Dvorak等，Stem Cells(干细胞)23，1200-1211(2005))。BMP4也不支持EpiSC/hESC自我更新，但是相反诱导EpiSC/hESC分化成滋养层或原始内胚层(Brons等，Nature(自然)448，191-195(2007)；Tesar等，Nature(自然)448，196-199(2007)；Xu等，Nat Biotechnol(自然生物技术)20，1261-1264(2002))。除了bFGF之外，已经表明激活蛋白A/Nodal信号传导支持hESCs/EpiSCs的未分化状态(Brons等，Nature(自然)448，191-195(2007)；Sato等，Dev Biol(发育生物学)260，404-413(2003)；Tesar等，Nature(自然)448，196-199(2007))，而对于mESCs不是必要的。这些结果强烈支持下述观点：EpiSCs和hESCs本质上是相似的，并且提出一种吸引人的假说，即，mESCs和EpiSCs/hESCs代表两种不同的多能状态：表示植入前内细胞群(ICM)的mESC-样状态，和表示后期上胚层细胞的EpiSC-样状态。

mESCs通常可以使用基于滋养层的细胞培养条件而来源于某些小鼠品系(Martin，G.R.，Proc Natl Acad Sci U S A(美国国家科学院学报)78，7634-7638(1981))。然而，已经证明在相似条件下很难由大鼠衍生真正的ES细胞。已经报道了大鼠ESC-样细胞的建立(Demers等，Cloning Stem Cells(克隆干细胞)9，512-522(2007)；Ruhnke等，Stem Cells(干细胞)21，428-436(2003)；Schulze等，Methods Mol Biol(分子生物学方法)329，45-58(2006)；Ueda等，PLoS ONE3，e2800(2008))，但是这些细胞不能稳定地保持或者缺少真正的体内多能性(例如，不能形成畸胎瘤或对嵌合体没有/有很少的贡献)。类似地，尽管已经衍生了(体外)多能性大鼠EpiSCs，但是大鼠和小鼠EpiSCs都表现出很少的能力或没有能力再结合到植入前的胚胎中并且形成嵌合体(Brons等，Nature(自然)448，191-195(2007)；Tesar等，Nature(自然)448，196-199(2007))。