[发明专利]基于DNA条形码的鉴别赤链蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒

权利要求书

1.用于鉴别赤链蛇的PCR扩增引物，其特征在于，所述引物序列为：

DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；

DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。

2.一种鉴定赤链蛇的PCR-RFLP方法，其特征在于，用能够识别赤链蛇特征DNA碱基序列的限制性内切酶APaL I对纯化后的PCR产物进行消化，形成琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；赤链蛇特征DNA碱基序列为：5’-GTGCAC-3’，其位于COI序列第362位至367位；所述鉴定方法包括以下步骤：

1)样品DNA的提取；

2)扩增DNA片段：利用权利要求1所述的引物进行聚合酶链反应，得到聚合酶链反应扩增产物，所述PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min；

3)琼脂糖凝胶电泳检测，纯化PCR产物；

4)所述PCR纯化产物中加入限制性内切酶APaL I进行酶切，所述限制性内切酶APaL I的酶切位点为：G^TGCAC；

5)琼脂糖凝胶电泳分析；

6)鉴定结果的判断：若在所述电泳产物中检测到分子量为362bp和296bp的两条片段，则待测样品为赤链蛇；若未出现上述两条片段，则待测样本非赤链蛇。

3.一种用于鉴别赤链蛇的PCR-RFLP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10μM引物DK1-CO1；10μM引物DK1-CO2；2×Taq DNA聚合酶混合缓冲液，其包括：0.1U/μL Taq DNA聚合酶，dATP、dTTP、dCTP及dGTP各500μM，20μM Tris-HCl、pH8.3，100μM KCl，3μM MgCl₂；10U/μL ApaL I酶；酶切缓冲液；终止缓冲液；灭菌双蒸水。