[发明专利]基于DNA条形码的鉴别赤链蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于中药品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别赤链蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒。

背景技术

赤链蛇(Dinodon rufozonatum)为游蛇科链蛇属的爬行动物，具有抗炎、镇静催眠、抗惊厥之功效，用于风湿性关节炎、解毒敛疮、全身疼痛、慢性瘘管、溃疡、疥癣等。赤链蛇是一种常见的金钱白花蛇伪品。随着近年金钱白花蛇药材价格的上涨以及资源的逐渐减少，越来越多的赤链蛇被用来充作金钱白花蛇。目前，市场上金钱白花蛇商品的50％为赤链蛇来源的伪品，两者从形态学上的特征进行鉴定较为困难。寻找快速、准确方法鉴别赤链蛇，是金钱白花蛇药材鉴定中的一个重要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确鉴别赤链蛇的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括赤链蛇的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、限制性内切酶酶切位点、鉴定方法及其试剂盒。

本发明基于DNA条形码。DNA条形码(DNA barcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别和鉴定的一项新技术。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提出建立以一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。随后的研究表明，COI(线粒体细胞色素氧化酶亚基I)基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。

本发明的技术方案如下：首先从各样本中提取总DNA，利用引物DK1-CO1及DK1-CO2，用PCR方法扩增COI片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，将所得序列登录到Genbank系统获得登录号，并建立各样品的DNA序列数据库；在比较数据库DNA序列的基础上，得到赤链蛇的特征DNA碱基序列：5’-GTGCAC-3’(位于COI序列第362位至367位)，针对赤链蛇与其他蛇类DNA序列的差异，选择合适的DNA限制性内切酶ApaL I，通过分析聚合酶链反应产物的限制性酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别赤链蛇的目的。

对需要鉴定的赤链蛇样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(DK1-CO1、DK1-CO2)扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶ApaL I对供试品的PCR扩增产物进行酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，赤链蛇会出现分子量为362bp，296bp的两条DNA片段，而其它种类的蛇不出现上述两条带。当供试品经本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定供试品是否为赤链蛇。

本发明用于鉴别赤链蛇的PCR扩增引物，其序列为：

DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；

DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。

本发明设计的用于鉴别赤链蛇PCR-RFLP分子鉴定方法，步骤如下：

1)提取待测样品DNA；

2)扩增DNA片段，PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min。所述引物DK1-CO1和DK1-CO2，其序列为：

DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’(SEQ ID NO.1)

DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’(SEQ ID NO.2)

3)纯化PCR产物，琼脂糖凝胶电泳分析；

4)PCR扩增产物中加入限制性内切酶APaL I进行酶切，限制性内切酶APaL I酶切位点为：G^TGCAC；

5)琼脂糖凝胶电泳分析；

6)鉴定结果的判断，若出现362bp和296bp的两条片段，则待测样品为赤链蛇；若不出现上述两条片段，则待测样品不为赤链蛇。

本发明方法的步骤1)和3)，采用现有技术的试剂盒提取DNA及纯化PCR产物的方法，不需要配制任何试剂，使得操作时间大大缩短。