[发明专利]一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多态性的HRM方法

权利要求书

1.一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多态性的HRM方法，其特征在于，其包括：在高分辨率熔解曲线分析技术基础上，针对目的基因的检测位点，选择特异性引物对和检测反应条件，完成目的基因的检测；

所述的目的基因的检测位点是CYP3A4*1G或者MDR1C1236T。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

(1)查找目的基因的DNA序列；

(2)针对目的基因的突变位点设计筛选特异性引物对；

(3)提取样本DNA，利用步骤(2)筛选的特异性引物进行基因扩增；

(4)琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物；

(5)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测，选用DNA饱和染料，参照对照样本HRM曲线完成对样本基因型的判断。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的特异性引物对含有目的基因靶序列中18-27个核苷酸构成的连续核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法在PCR反应体系中进行；

所述的PCR反应体系包括引物、DNA聚合酶、dNTPs、Mgcl₂、模板DNA、PCR缓冲液和荧光染料。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的PCR反应体系的组成及其终浓度为：

。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述dNTPs混合液是包括0.4mMdATP、0.4mMdTTP、0.4mMdGTP、0.4mMdCTP的混合液。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的荧光染料为DNA饱和染料SYTO-9。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法在PCR反应体系中进行；

所述PCR反应体系按照20μL为单位，各组分及其体积比例如下：

。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在目的基因的PCR扩增程序中，进行PCR扩增反应的条件为95℃预变性10min，95℃变性30s，50-65℃退火30s，72℃延伸30s，72℃继续延伸5min，40个循环。

10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物，是通过梯度PCR，进行目的基因扩增产物退火温度的选择。

11.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述HRM曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测；

所述的进行突变位点检测的产物熔解程序中，进行产物熔解检测的条件为95℃变性2min，40℃复性2min；然后初始熔解温度60-65℃开始程序升温熔解至95℃，并在熔解过程中实时检测荧光信号，25-45次每秒；然后40℃进行冷却10s。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，CYP3A4*1G的熔解曲线温度设定范围为79～88℃。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，MDR1C1236T的熔解曲线温度设定范围为80～88℃。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法按照如下步骤进行：

1)查找目的基因CYP3A4*1G和MDR1C1236T的DNA序列；

2)针对目的基因的突变位点设计筛选合适的引物对；

3)提取样本DNA，利用步骤(2)筛选的引物进行基因扩增；

4)琼脂糖凝胶电泳法分析PCR产物是否为特异性扩增；

5)根据高分辨率溶解曲线法对扩增后的目的基因的突变位点进行检测，选用SYTO-9饱和荧光染料，参照对照样本HRM曲线完成对样本基因型的判断。

15.根据权利要求1-14中任意一种所述的方法，其特征在于，所述的模板DNA从健康人全血样本中提取。

16.一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多态性的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括针对目的基因的突变位点设计的特异性引物对；

所述的目的基因的检测位点是CYP3A4*1G或者MDR1C1236T。