[发明专利]一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多态性的HRM方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，涉及与药物动力学相关的基因检测。尤其涉及一种检测CYP3A4*1G和MDR1C1236T的基因多态性的HRM方法。利用本发明的方法，一次可完成大量样本的快速检测，方法简便，准确可靠省时省力，为临床个体化合理用药提供方便。

背景技术

高分辨率熔解曲线分析技术(HighResolutionMelting),简称HRM，是由美国犹他大学和爱德华科技公司合作开发的一种SNP以及突变研究的工具，能检测人类84％的SNP(单核苷酸多态性)。HRM基于核酸分子物理性质的不同影响解链温度，通过实时检测升温过程中饱和荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，从荧光强度和时间曲线上判断是否存在SNP。核苷酸双链的热稳定性受碱基组成、长度和GC含量的影响，序列改变会引起升温过程DNA解链行为的改变。SNP位点若不匹配会使双链DNA在升温过程中解链，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，仪器获得的荧光信号将会减弱。不同SNP位点、杂合子与纯合子等都会影响熔解曲线的峰型，进而有效区分不同基因型。应用HRM曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到单个碱基差异的区分。单个碱基引起的解链温度差异可能不到1℃，HRM具有很高的温度分辨率，可以每步升温0.02～0.1℃，每升高一摄氏度采集荧光25次，可满足单碱基差异的区分。HRM基于高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行HRM即可完成对样品突变、SNP、甲基化等的分析。

HRM技术应用于基因突变检测依据于饱和荧光染料，根据荧光信号强度的微妙变化来判断基因类别，有着很高的灵敏度和准确度。相对于非饱和染料，饱和染料具有更强的DNA结合作用和较小的PCR抑制作用，使得DNA在解链过程中不会发生重排，熔解曲线有更高的分辨率。近年来在HRM中应用较多的饱和染料有LCGreen、LCGreenPlus、EvaGreen和SYTO-9。

基因指导下的个体化用药越来越受到重视，20％～95％的药物反应和处置的个体差异是由遗传因素引起的。基因多态性的存在可能导致治疗中不同患者的疗效和不良反应的差异，许多科学家认为编码药物代谢酶、药物转运体和药物作用。

靶点的基因序列的不同是引起同一种药物相似剂量在不同个体间产生不同反应的主要原因。FDA和欧洲EMEA分别于2005年和2010年颁布或起草了关于新药临床试验中提供药物基因组学数据的指导文件。

CYP3A4是CYP3A家族中一个高表达的亚族酶系，CYP3A4*1G在亚洲人的变异频率较高。CYP3A4*1G位于CYP3A4内含子10，造成82266位置G到A的取代(20230G>A,rs2242480)，有研究报道CYP3A4*1G的表达对CNI类免疫抑制剂如环孢素和他克莫司的药动学有影响。

P-gp是MDR1编码的ATP依赖的跨膜受体，通过在肠道的外排泵活性阻碍环境毒素和药物等外源物质的吸收，保护敏感组织及作用底物的排泄，因此会造成药物处置和相互作用上的差异，进而影响到药物的疗效和不良反应。目前已研究了95个MDR1位点，其中有74个位点具有多态性，研究较多的位点有MDR1C1236T、G2677T/A、C3435T等。C1236T(rs1128503)位点位于第12个外显子，其变异属于不引起氨基酸变化的同义突变。

SNP的主要检测方法有以凝胶电泳为基础的传统经典法和近些年来发展起来的高通量、自动化程度较高的测序法，如限制性片段长度多态性法(RFLP)、单链构象多态性法、变性梯度凝胶电泳、等位基因特异性PCR、DNA直接测序法、DNA芯片检测、飞行质谱仪检测、变性高效液相色谱法等。目前普遍应用的基因突变检测方法有RFLP法和DNA直接测序法。RFLP法将PCR与限制性酶切相结合，因其实验操作繁琐、检测周期较长、第一轮酶切不完全导致假阳性结果以及只能用于已知SNP的判断，无酶切位点的不能检测等因素，只适合少量样本的检测。变性梯度电泳法有商品化的电泳装置，适合大样本检测筛选，但因为该法是利用温度和梯度凝胶迁移率来进行检测的，需要进行凝胶电泳，DNA链二级结构容易造成人工假相，导致结果出现偏差。DNA直接测序法中PCR产物在全自动测序仪上电泳后进行测序，方法先进，但是工作量大，耗时较长，价格昂贵，不适合大样本的检测。