[发明专利]紫脚板薯组织RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及RNA提取方法。 

背景技术

紫脚板薯系薯蓣科（Dioscoreaceae）薯蓣属（Dioscorea）多年生缠绕性藤本植物，由于其薯型为脚板状，肉为紫色而得名。紫脚板薯含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素、多糖、微量元素以及膳食纤维，是集食、药为一体的保健食品。淀粉的糖技术发展在中国有很大的市场，可通过现代生物工程技术将其转化制造酒精、醋、糖饴等工业原料^[2]，而紫脚板薯以其产量高(亩产量可达数吨)，淀粉含量高的特点，逐渐崭露头角，有望成为食、药、能源三位一体的“超级作物”。 

随着对其重要性的认识，对于紫脚板薯的研究也广泛的展开。其中，对紫脚板薯进行基因克隆，功能分析，遗传改良等，首先是要得到高质量的RNA。然而，紫脚板薯体内富含多酚和次生代谢物，严重地影响了紫脚板薯RNA的提取。目前，国内广泛应用的Trizol法、异硫氰酸胍一步法（Ghawana, Paul et al. 2011；Eldh, L?tvall et al. 2012），以及己报道的其他植物组织总RNA提取的方法在应用于紫脚板薯组织RNA的提取时都不能得到满意的效果。 

发明内容

本发明目的在于提供一种从能够有效从紫脚板薯组织中提取高质量总RNA的方法。具体技术方案如下： 

紫脚板薯组织RNA的提取方法，包括如下步骤： （1）将RNA提取液65度水浴15 min；所述RNA提取液为2% SDS，100mM Tris，25mM EDTA，2M NaCl溶液； （2）每取0.5 g紫脚板薯组织材料放入预先加好0.03 g聚乙烯吡咯烷酮PVPP的研钵中，加液氮迅速研磨至粉末； （3）粉末转移至离心管中，加0.6 ml RNA提取液和24 μl β-巯基乙醇，涡旋数秒后水浴10 min； （4）加0.6 ml 体积比24: 1氯仿异戊醇后剧烈震荡1 min后，13000 rpm离心8 min； （5）取上清，加2.5倍体积的乙醇和0.1倍体积的3 mol/L pH5.2 KAC，混匀，冰浴10 min，13000 rpm离心10 min； （6）弃上清，加1 ml 70%乙醇洗涤，13000 rpm离心5 min，弃上清，稍离心，使残液集于管底，用移液器吸去，置于超净工作台上用无菌风吹2-5 min, 加43 μl 水溶解； （7）加5 μl DNase Buffer，2 μl DNase，温和混匀，37℃ 30 min； （8）加350 μl 水、200 μl 酸酚、200 μl 氯仿异戊醇，震荡1 min，13000 rpm离心10 min； （9）取上清，加等体积的氯仿异戊醇，氯仿异戊醇体积比24：1，震荡1 min，13000 rpm离心10 min； （10）取上清，加2.5倍体积的乙醇和0.1倍体积的3 mol/L pH5.2 KAC，混匀，冰浴10 min，13000 rpm离心10 min； （11）弃上清，加1 ml 70%乙醇洗涤，13000 rpm离心5 min，弃上清，稍离心，使残液集于管底，用移液器吸去，置于超净工作台上用无菌风吹2-5 min, 加适量水溶解。

为达到更好的提取效果：配置的试剂均用RNase-free ddH₂O配置；实验所用枪头、离心管均用0.1% DEPC水浸泡过夜后高压灭菌；所用研钵和玻璃器皿经锡纸包裹后200℃烘烤4-6h。 

本发明的有益效果在于：本发明方法能高效的从紫脚板薯各个组织中提取高质量总RNA。 

附图说明

图1  本发明方法不同组织RNA电泳图。注：M为maker；1为根；2为茎；3为雌蕊；4为萼片；5为花瓣；6为叶子；7为雄蕊。 

图2  其他方法所提取的RNA电泳图。注：A为Trizol法，B为某知名生物公司的RNA提取试剂盒。 

具体实施方式

实施例1 

1.1 植物材料

紫脚板薯种苗由南昌绾翠园实业有限公司提供，于开花时取植物的根、茎、叶、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，置于液氮中保存。

1.2 主要试剂和用具