[发明专利]一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种原核载体构建方法，具体涉及一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法。 

背景技术

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus，V.alginolyticus)为革兰阴性菌，分布于海域、河口地区，可引起水产鱼类败血症和胃肠炎，造成大量死亡，严重影响水产养殖业的发展；也可引起人类胃肠道疾病与伤口感染；是一种人和海洋动物共感染的病原菌。 

溶藻弧菌外膜蛋白(Outer membrance proteins，OMPs)是外膜的重要组成部分，在感染和诱导宿主免疫反应上起重要作用；其中外膜蛋白K(Outer membrance protein K，OmpK)为溶藻弧菌主要的外膜蛋白，在不同弧菌间具有序列保守性，存在交叉免疫反应，是弧菌间共同抗原的分子基础。此外，OmpK对弧菌感染具有很好的免疫保护作用，在疫苗上有很好的应用前景。 

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，并对OmpK蛋白发酵的实验室小试条件进行研究。 

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为： 

溶藻弧菌外膜蛋白OmpK原核载体构建方法，包括如下步骤： 

S1、根据NCBI公布的基因序列，设计ompK基因引物：Primer1：5’-ACA GGATCCATGCGTAAATCACTTTT-3’；Primer2：5’-ACTCTCGAGTTAGAATTTGTAAGTTAC-3’； 

S2、提取溶藻弧菌基因组DNA； 

S3、以S2中提取的溶藻弧菌基因组DNA为模板，进行ompK基因的PCR扩增； 

S4、取S3中的PCR扩增产物采用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR片断大小； 

S5、将S3中的PCR扩增产物与pET-23a质粒载体进行BamH I和Xho I双酶切后，通过T4-连接酶将目的基因插入pET-32a质粒中，转化E.coli DH5a菌株，提取重组质粒后，进行BamH I和Xho I双酶切鉴定，并对重组质粒进行测序测定，与步骤S1所设计的基因引物进行对比，转化重组质粒入E.coli BL21表达菌株。 

优选的，所述步骤S3中PCR扩增条件为：PCR扩增采用50μL反应体系，反应缓冲液5μL，基因组模板3μL，10mmol/L dNTP2μL，25umol/L引物各1.5μL，Taq酶0.5μL，补水至50μL。 

PCR扩增反应条件为：94℃变性3min；30个循环：94℃变性40s，55℃退火45s，72℃延伸60s；72℃延伸10min，最后4℃保温。 

其中，本发明通过选用L₉(3⁴)正交试验，得出了OmpK菌株最佳诱导表达条件为：诱导时菌液OD₆₀₀值0.8，加IPTG终浓度0.3mmol/L，诱导时间8h，温度32℃；最佳培养条件为：转速230rpm，葡萄糖浓度0％，装液量50mL。 

本发明的有益效果如下： 

上述方案中，成功构建OmpK表达载体，确定OmpK蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件，为OmpK工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。利用切胶纯化蛋白方法获得OmpK蛋白，免疫小鼠，制备多克隆抗体，再通过ELISA与Wester-Blotting方法检测多抗的效价与特异性。并通过L₉(3⁴)正交试验设计，筛选OmpK工程菌最佳表达与培养条件。 

附图说明

图1为溶藻弧菌ompK基因重组质粒构建对比图。 

A：PCR扩增ompK基因：1，阴性对照；2，ompK基因；B：BamH I与Xho I双酶切检测ompK基因重组质粒：1，ompK重组质粒；2，ompK重组质粒BamH I+Xho I双酶切。 

图2为OmpK蛋白表达与纯化图。 

M，Protein marker；1，未诱导菌株；2，IPTG诱导菌株；3，OmpK蛋白纯化。 

图3为OmpK多克隆抗体效价的测定结果图。 

图4为OmpK多克隆抗体特异性的Western-Blotting检测结果图。 

A，1∶400倍稀释的抗血清；B，1∶800倍稀释的抗血清；C：1∶1600倍稀释的抗血清；D：1∶400倍稀释的阴性对照血清。