[发明专利]甲型流感病毒亚型基因型定型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒基因型的确定，具体地说，涉及一种甲型流感病毒亚型基因型定型的新方法。

背景技术

流感是流行性感冒(influenza)的简称，是由流感病毒(influenza virus)引起的一种急性呼吸道传染病。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)，是一种有囊膜的基因组分8个节段的负链RNA病毒。根据流感病毒的核蛋白和基质蛋白的抗原性不同，将流感病毒分为三型：甲型流感病毒(Influenza A virus)；乙型流感病毒(Influenza B virus)；丙型流感病毒(Influenza C virus)。其中甲型流感病毒可感染人类，及鸟类、猪等其他动物，依据病毒包膜蛋白血凝素(haemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)的抗原性的不同，甲型流感病毒又可进一步被分为不同的亚型。截止目前，人们已经发现有18个亚型的HA蛋白(H1-H18)和11个亚型的NA蛋白(N1-N11)，其中较常见的是16个HA亚型和9个NA亚型，通常感染人的亚型为H1N1，H2N2，H3N2等。历史上已经历过四次流感大流行，在短时间内在全球迅速蔓延，引发了人们极度的恐慌。另外，近年来发生的禽流感病毒直接跨宿主感染人，并造成高致病力和高致死率的甲型流感病毒，如H5N1，H7N9，H9N2的感染，也严重威胁人类健康。因此，快速确定甲型流感病毒流行的基因型对流感病毒感染的预防具有重要意义，而目前主要通过对甲型流感病毒编码区(Open Reading Frame，ORF)的亚型序列性特征来确定甲型流感病毒亚型的，而利用甲型流感病毒编码区来确定病毒亚型还存在以下缺陷：1)亚型特异性编码区序列在每种HA和NA亚型编码序列中的位置不固定；2)亚型特异性编码区序列除亚型间的差异外，在每一种亚型内，亚型特异性编码区序列还具有宿主特异性，即序列和位置均不同，因此，目前对于新发突发甲型流感病毒的定型中，通常采取测通整个HA和NA的ORF，再与各种亚型特异性编码区序列及每种亚型内宿主特异性的亚型特异性编码序列进行比较，来确定病毒基因型；或者利用PCR方法，即使用针对各种编码区内的亚型特异性序列设计的引物(包括亚型间及亚型内差异设计的引物)来做PCR，然后通过是否出现特异性的PCR产物来确定病毒基因型。

甲型流感病毒的8个RNA片段是由两端的(3′端和5′端)非编码区(noncoding regions，NCRs)和中间的编码区(coding regions)构成。而非编码区是由高度保守的甲型流感病毒RNA启动子序列(12个3′端碱基和13个5′端碱基)和片段特异性的非编码序列(长度和序列均不同)组成，而针对HA和NA这两个片段，它们的片段特异性的非编码序列却有所不同，但一直未受到人们的关注。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种利用甲型流感病毒HA和NA基因非编码序列进行甲型流感病毒亚型基因型定型的方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种甲型流感病毒亚型基因型定型的方法，利用甲型流感病毒HA和NA基因片段特异性的非编码序列在5′和3′端同时具有亚型特异性，对甲型流感病毒亚型基因型进行定型。

进一步地，所述亚型特异性在于：不同亚型的HA和NA基因在5′和3′端的非编码序列长度存在差异。

进一步地，所述亚型特异性在于：不同亚型的HA和NA基因在5′和3′端的非编码序列的核苷酸序列存在差异。

更进一步地，所述方法具体包括如下步骤：

1)分析NCBI流感病毒数据库中所有甲型流感病毒的5′和3′端非编码区，构建HA和NA基因亚型特异性非编码序列的特征图谱(如图1所示)；

2)测定样品的HA和NA基因非编码序列，与步骤1)得到的特征图谱进行比对，根据特征图谱中不同亚型非编码序列的长度特征和核苷酸序列特征判断样品的亚型基因型。

所述测定样品的HA和NA基因非编码序列的方法较多，如直接利用深度测序来确定病毒非编码序列，或利用甲型流感病毒的启动子序列(12个3′端碱基和13个5′端碱基)作为引物，扩增HA和NA基因，克隆入载体进行非编码区的测序，或利用专门开发的测定流感病毒非编码序列的方法(如末端连接法)，以及常用的5′RACE和3′RACE试剂盒等方法，都可来测定HA和NA基因的非编码序列。