[发明专利]一种检测苯二氮卓类药物残留试剂盒的制备

权利要求书

1.检测苯二氮卓类药物残留的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括酶标板、BZD标准品、BZD抗体工作液、BZD酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液和浓缩洗涤液。

2.检测BZD的ELISA试剂盒的制备及检测方法，包括以下步骤：酶标板的制备、一系列BZD标准品的制作、单克隆抗体及其工作液的制备、酶标二抗工作液的制备、洗涤液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备。

3.根据权利要求2所述检测BZD的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的包被抗原是将药物残留半抗原与载体蛋白偶联得到的，该载体蛋白为牛血清白蛋白(BSA)；用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将BZD-BSA抗原稀释成1：3200比例，100μL/孔，37℃放置2h，取出酶标板甩掉板内液体，用稀释后的浓缩洗涤液250μL/孔，洗板2次，30s/次；然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭，150μL/孔，37℃放置1.5h，弃去封闭液，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干；抽检合格后将酶标板真空密封后置4℃下保存。

4.根据权利要求2所述检测BZD的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的一系列标准品浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

5.根据权利要求2所述检测BZD的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的蛋白质偶联物单克隆抗体是采用人工抗原免疫兔所得，该抗体工作液用抗体稀释液稀释成1：12000。

6.根据权利要求2所述检测BZD的ELISA试剂盒的制备及检测方法，其特征在于：所述的BZD酶标二抗工作液用酶标二抗稀释液稀释成1：3000比例；所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液；所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液；所述终止液为2mol/L的硫酸；所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，其包含0.5%吐温-20，0.01mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

7.权利要求2所述的检测BZD的ELISA试剂盒的制备及检测方法，基于抗原抗体进行间接竞争酶联免疫反应，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液工作液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有BZD-BSA抗原的酶标板，加标准品/样本60μL/孔到对应的微孔中；

(4)加入40μL抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；然后加入100μL/孔酶标二抗工作液，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；

(5)小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(6)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；

(7)加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处或双波长450/630nm检测，测定每孔吸光度值（请在5min内读完数据）；

(8)以标准品测试的吸光度值与标准品的浓度对数值绘制标准曲线，对照标准曲线计算样品中BZD的含量。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述处理后的样品是经过以下处理的样品：

(1)配制样品复溶液（甲醇：1MHCL=9:1）；

(2)称量3g样品，研磨成粉；

(3加入样品复溶液6ml混合，以4000r/min,离心10min；

(4)取上层液进行氮吹，加入1ml正己烷及1ml样复进行复溶；

(5)以4000r/min离心5min，去除上层，取下层进行分析。