[发明专利]一种检测苯二氮卓类药物残留试剂盒的制备

说明书

技术领域

本发明涉及酶联免疫检测技术领域，特别是检测苯二氮卓类的酶联免疫试剂盒。

背景技术

BZD是一类作用突出的化合物，具有抗惊厥、抗焦虑、松弛肌肉和安眠的临床作用，且毒性较小。国外在70年代对BZD食欲促进剂做了大量深入的研究，试验了1500中化合物对动物摄食的影响，发现多种BZD化合物可促进动物摄食，其中乙磺氟安定的效果最为显著。肌注、灌服及日粮添加均可有效增加健康动物特别是反刍动物的摄食量及摄食频率，提高日摄食量。近几年来有些饲料企业为了追求饲料的转化率和高额利润，在饲料中随意添加镇静、催眠类违禁药物。医学界已经证实畜禽产品中的激素及其它合成药物的连用与残留往往与人类常见的疾病问题及某些食品中毒有关。

目前，BZD的测定方法主要有高效液相色谱法、气相色谱法、薄层层析法、高效液相色谱-质谱联用法等，其检测结果准确可靠，但仪器设备比较昂贵，且样本前处理过程相对复杂。酶联免疫吸附法是一种准确、可靠、快速、特异的检测方法，适合于大批样品的快速筛选，近年来已广泛应用于食品安全检测行业。本发明旨在建立一种检测BZD的酶联免疫试剂盒及其检测方法。

发明内容

为了克服色谱法的不足，本发明提供一种检测BZD的酶联免疫试剂盒及其检测方法。该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。

发明内容

本发明检测玉BZD的酶联免疫试剂盒，包括酶标板、BZD标准品、BZD抗体工作液、BZD酶标二抗工作液、底物液A、底物液B、终止液、浓缩稀释液和浓缩洗涤液。

本发明检测苯二氮卓类的酶联免疫试剂盒的制备，包括以下步骤：酶标板的制备、BZD标准品的制备、玉BZD抗体工作液的制备、BZD酶标二抗工作液的制备、底物液A的制备、底物液B的制备、终止液的制备、浓缩稀释液的制备和浓缩洗涤液的制备。

其进一步特征在于：所述的酶标板经由BZD抗原包被制备，具体步骤是将BZD半抗原与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联得到包被抗原，用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐(CBS)缓冲液作为包被液，将BZD包被抗原稀释成1：3200比例，100μL/孔，37℃避光孵育2h，取出酶标板甩掉板内液体，加入经稀释的浓缩洗涤液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封闭液，150μL/孔，37℃放置1.5h，甩掉封闭液直接拍干，拍干后的酶标板放置恒温间(25℃)晾干，抽检合格后将酶标板真空密封于4℃条件下保存。

BZD标准品浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。

所述BZD抗体工作液是采用BZD人工抗原免疫小鼠得到单克隆抗体，用抗体稀释液稀释成1：12000比例制备。

所述BZD酶标二抗工作液由酶标二抗加稀释液稀释成1：3000比例，所述底物液A为含有0.5mmol/L的过氧化氢脲的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，所述底物液B为四甲基联苯二胺的乙醇溶液，所述终止液为2mol/L的硫酸，所述浓缩稀释液是10倍浓缩稀释液，为0.1mol/L的PBS，pH值范围7.0-7.5之间，所述浓缩洗涤液是10倍浓缩洗涤液，为含0.5%吐温-20，0.1mol/L的PBST，pH值范围7.0-7.5之间。

检测BZD的酶联免疫试剂盒及其检测方法，基于抗原抗体的间接竞争酶联免疫反应原理，该方法包括以下步骤：

(1)预处理待测样品，即将待测试的样品处理为液体样品，或者用有机溶剂提取待测样品，并将其复溶于样品稀释液中；

(2)将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温（20～25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀；

(3)取包被有BZD抗原的酶标板，加标准品/样本60μL/孔到对应的微孔中，加入BZD抗体工作液，40μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温25℃避光环境中反应30min；用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(4)再加入BZD酶标二抗工作液，100μL/孔，然后小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μL/孔，充分洗涤4~5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)；

(5)加入底物液A50μL/孔，底物液B50μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应30min；