[发明专利]一种检测脂肪酶酶活的荧光法有效
申请号: | 201410359221.8 | 申请日: | 2014-07-24 |
公开(公告)号: | CN104597006B | 公开(公告)日: | 2018-02-06 |
发明(设计)人: | 田丹碧;汤燕;黄和;江凌;张卫;许智玲 | 申请(专利权)人: | 南京工业大学 |
主分类号: | G01N21/64 | 分类号: | G01N21/64 |
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地址: | 211816 江苏省南京市浦*** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 脂肪酶 荧光 | ||
技术领域
本发明属于分析化学领域,具体涉及一种使用天然物质姜黄素作为荧光信号元件,吐温既作为脂肪酶的底物又作为包裹信号分子姜黄素的载体的检测脂肪酶酶活的化学荧光法。
背景技术
脂肪酶(三酰基甘油酯水解酶,EC 3.1.1.3)是作用于羧酸酯键的一类水解酶,它能够在非水介质中催化酯化,酯交换和酯基转移反应。这种多功能的化学反应特点,它已经被广泛应用于食品,洗涤剂,制药,皮革,纺织,化妆品和造纸等诸多工业领域。随着脂肪酶应用领域不断拓宽,因而建立一种成本低、操作简单、方便快捷的检测脂肪酶酶活的方法显得尤为重要。
目前,采用荧光法来检测脂肪酶酶活的有很多,其中最为常用的方法是利用三酰基甘油类似物修饰上一个荧光分子芘和猝灭剂和4-甲基伞形酮庚酯作为脂肪酶的荧光底物进行检测。前者的缺点在于三酰基甘油类似物修饰上一个荧光分子芘会引起某些脂肪酶差的水解性,这样就会导致检测出的酶活不准确;后者的缺点在于该底物需要乳化,乳化剂的加入会影响酶活的测定,且都受到pH 范围的限制。因此,这两种方法都不能广泛地作为检测脂肪酶标准的试验方法。
姜黄素是一种具有荧光的天然物质,一般都应用于医药行业,很少利用到它的荧光特性来检测目标物,更别说来检测脂肪酶酶活。
现有技术未公开基于吐温包裹姜黄素的荧光法来检测脂肪酶酶活的技术方案。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于吐温包裹姜黄素的荧光法来检测脂肪酶的简单、廉价和有效的分析法。此方法利用天然物质姜黄素具有荧光的特点,将姜黄素作为荧光信号元件,同时吐温既作为脂肪酶的底物又作为包裹信号分子姜黄素的载体。
本发明在解决上述技术问题所采用的技术方案如下:
一种检测脂肪酶酶活的荧光法,具体包括如下步骤:
(1)分别向2mL A、B离心管中加入吐温溶液;
(2)向步骤(1)中得到的A、B离心管溶液中加入由甲醇溶液配制的姜黄素溶液进行包裹;
(3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液分别加入缓冲溶液进行pH的调节;后向B离心管加入待测脂肪酶溶液,A离心管不需要加入待测脂肪酶溶液;混匀,调节反应温度,B离心管中的吐温溶液的胶束结构被脂肪酶水解,姜黄素暴露在缓冲溶液当中发生降解,检测A、B离心管溶液的荧光光谱,得到不同时间对应的荧光光谱,然后以荧光强度的差值ΔF505作为纵坐标,时间为横坐标,绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
本发明所述的方法,所述步骤(1)中加入吐温溶液的浓度为0.05-0.35 mmol/L,优选0.3mmol/L。
其中,所述步骤(2)中由甲醇溶液配制的姜黄素溶液的浓度为5-40 μmol/L,优选25μmol/L。
其中,所述步骤(3)中的缓冲溶液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠-氯化钠缓冲溶液,该缓冲溶液的浓度及具体用量为本领域技术人员所理解和掌握,具体以最终形成吐温包裹姜黄素溶液pH值调至7-9为准,优选7.4。
其中,所述步骤(3)中待测脂肪酶溶液反应温度为30-50℃,优选37℃;待测脂肪酶酶溶液的加入量为0.25-5mg/mL,优选2mg/mL。
更具体地,本发明所述的一种检测脂肪酶酶活的荧光法,包括如下步骤:
(1)分别向2mLA、B离心管中加入吐温溶液的最终浓度为0.3mmol/L;
(2)向步骤(1)中得到的A、B离心管溶液中加入由甲醇溶液配制的姜黄素溶液的浓度为25μmol/L进行包裹;
(3)向步骤(2)中得到的A、B离心管溶液分别加入缓冲溶液进行pH的调节,将pH值调至7.4;后向B离心管加入待测脂肪酶溶液,A离心管不需要加入待测脂肪酶溶液;混匀,调节反应温度至37℃,B离心管中的吐温溶液的胶束结构被脂肪酶水解,姜黄素暴露在缓冲溶液当中发生降解,检测A、B离心管溶液的荧光光谱,得到不同时间对应的荧光光谱,然后以荧光强度的差值Δ F505作为纵坐标,时间为横坐标,绘制脂肪酶酶活的动力学曲线。
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