[发明专利]一种提取及培养脂肪干细胞的方法

权利要求书

1.一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，该方法步骤为：

(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；

(2)将脂肪组织绞碎为1-2mm³小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，放入摇床中，温度为37℃，190rpm，消化时间为30min；加入等体积的含有15％FBS的BME培养基终止消化；

(3)静置分层，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞；

(4)将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于37℃、CO₂浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞。

2.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，，所述的消化液为胰酶-EDTA和I型胶原酶的D-Hank’平衡盐溶液；其中胰酶-EDTA的浓度为0.05-0.5％，I型胶原酶的浓度为0.05-0.5％。

3.根据权利要求2所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，所述的消化液中，添加IV型胶原酶，其浓度为0.1-0.5％。

4.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，所述的消化液是浓度分别为0.1％的胰酶-EDTA、0.1％的I型胶原酶和0.2％的IV型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液。

5.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，在过滤后，将脂肪干细胞悬浮液和红细胞裂解液以1：1混合孵育2分钟，4℃、离心力450g条件下离心5min，利用脂肪干细胞培养基重悬脂肪干细胞。

6.根据权利要求1所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，所述的培养液由L-谷氨酰胺1-5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子5-30ng/ml，表皮生长因子1-20ng/ml，白血病抑制因子1-20ng/ml，谷胱甘肽5-20μg/ml，BME补足至100％组成。

7.根据权利要求6所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，所述的培养液由L-谷氨酰胺1mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子20ng/ml，表皮生长因子5ng/ml，白血病抑制因子5ng/ml，谷胱甘肽10μg/ml，BME补足至100％组成。

8.根据权利要求7所述的一种脂肪干细胞的提取及培养方法，其特征在于，所述的培养液中，添加50μg/ml虫草提取物。