[发明专利]一种提取及培养脂肪干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是一种提取及培养脂肪干细胞的方法。

背景技术

脂肪干细胞(Adipose-derived Stem Cells，ADSCs)，是目前广泛应用于组织工程及再生医学研究领域的一种成体干细胞(Cowan CM,.Nat Biotechnol，2004.22:560-567)。脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能，在特定条件下可以向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、成内皮细胞和成神经细胞等多个方向分化。除此之外，脂肪干细胞还具有许多其他类型成体干细胞所不具备的优势，如脂肪组织来源充足、取材方便、获取过程损伤轻微、无伦理学争议，平均每100mL的脂肪组织中可获得约1×10⁶个干细胞，脂肪组织来源的细胞约有2％具有干细胞特征，远高于骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)(约0.02％的细胞具有干细胞特征)。并且脂肪干细胞具有稳定的群体倍增率、自我更新潜能及良好的免疫相容性(Strem BM，Trends Biotechnol，2005.24:1246-1253)，其基因转染效率高、能稳定表达外源基因，已广泛应用于再生医学的研究(Gimble JM,.Circ Res,2007:1249-1260)。而且ADSCs分化为脂肪细胞的效率比BMSCs更高。因此，脂肪干细胞是组织工程研究理想的种子细胞之一，最有希望成为脂肪组织工程的种子细胞。

目前常用的脂肪干细胞分离培养方法是从脂肪组织分离获取细胞，经机械或酶处理方法分离除去红细胞等成熟细胞后，采用含10％胎牛血清的培养基进行继代培养。含10％胎牛血清的培养基虽可促进脂肪干细胞的增殖，但难以维持其未分化状态，随着传代次数增加，细胞增殖能力下降，形态由长梭形变为宽大扁平，逐渐丧失多向分化能力。另外，动物血清可能存在动物携带的潜在病毒或支原体污染，对以后可能的临床应用构成威胁。尽管研究人员尝试了很多的无血清培养基方案，但间充质干细胞在无血清培养基中普遍存在生长缓慢，多向分化能力逐渐消失的问题。

现有常规的机械或酶处理方法仅能除去红细胞等成熟细胞，除红后的这部分细胞中仍含有大量成熟细胞，因而，现有获得的脂肪干细胞纯度不高，由于细胞的生长和细胞之间的信号交通有关，纯度不高的干细胞更易老化，往往在体外经5-6次传代培养脂肪干细胞后，脂肪干细胞就出现老化。干细胞老化(或称衰老)，是指干细胞增殖能力下降，多向分化潜能(或称干性)降低或消失。老化意味着干细胞数量的减少和功能的减退，也可以说是无法再生。脂肪干细胞的老化限制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中应用的深入研究。

发明内容

为克服现有常规的机械或酶处理脂肪干细胞分离培养方法存在的缺陷，本发明提供一种脂肪干细胞的提取及培养方法，该方法具有消化速度快，不溶性组织块大幅减少，而且不影响干细胞活性等优点，该方法的步骤是：

(1)取人脂肪组织，用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复离心冲洗，离心去除多余的水溶液和血液；

(2)将脂肪组织绞碎为1-2mm³小块，加入与所取脂肪组织等体积的消化液进行消化，放入摇床中，温度为37℃，190rpm，消化时间为30min；加入等体积的含有15％FBS的BME培养基终止消化；

(3)静置分层，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hank’s平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，离心弃去上清液，获得干细胞；

(4)将获得的干细胞按照2-3×10⁴/cm²的密度接种于培养瓶，加入培养液，置于37℃、CO₂浓度5％、湿度95％的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加0.25％胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞。

本发明所述的消化液为胰酶-EDTA和I型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液；其中胰酶-EDTA的浓度为0.05-0.5％(g/100ml，下同)，I型胶原酶的浓度为0.05-0.5％；进一步地，在所述消化液中，还可添加IV型胶原酶，其浓度为0.1-0.5％，在最优选的实施方案中，所述消化液是浓度分别为0.1％的胰酶-EDTA、0.1％的I型胶原酶和0.2％的IV型胶原酶的D-Hank’s平衡盐溶液。