[发明专利]一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶及其制备方法

权利要求书

1.一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶，其特征在于所述的T4噬菌体多核苷酸激酶的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：通过载体构建将密码子优化的T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；所述T4噬菌体多核苷酸激酶基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；T4噬菌体多核苷酸激酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T4 PNK；所述融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。

3.根据权利要求2所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于所述载体构建步骤具体为如下步骤：

引物设计如下：

所用正向引物为：5’-CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3’；下划线部分为BamHI的酶切位点；

所用反向引物为：5’-CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3’；下划线部分为XhoI的酶切位点；

以合成的T4 PNK为模板，用PCR的方法扩增T4 PNK编码序列，PCR反应条件为：94℃热变性1分钟，55℃退火1min，72℃延伸90秒，共进行25个循环；纯化的PCR产物用BamHI和XhoI进行双酶切，然后插入pGEX的多克隆位点；对融合蛋白表达载体pGEX-T4 PNK进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。

4.根据权利要求2所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于所述融合表达步骤具体为如下步骤：

分别将融合蛋白表达载体pGEX-T4 PNK和对照载体pGEX转入表达宿主菌Escherichiacoli BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l氨苄青霉素的LB培养基；待细菌长至OD₆₀₀为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导T4 PNK的表达；将诱导过程中的温度设定为15°，诱导两个小时后收集菌体。

5.根据权利要求2所述的一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶的制备方法，其特征在于所述纯化融合蛋白步骤具体为如下步骤：

收集一升发酵液的细胞，并用40ml冰浴的PBS重悬，所述PBS的构成为137mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄·12H₂O，2mM KH₂PO₄，pH7.4，冰浴超声裂解细胞，离心取上清，上清通过PBS预平衡的GST resin，上样完毕用PBS充分洗涤，最后用GST洗脱液，所述GST洗脱液的构成为0.154g GSH溶于50ml 50mM Tris-HCl，洗脱目的蛋白；GST亲和层析去除了绝大部分菌体杂蛋白，离子交换进一步去除杂蛋白和痕量的DNA。