[发明专利]一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种T4噬菌体多核苷酸激酶(T4 bacteriophage polynucleotide kinase，T4PNK)的表达和纯化，特别涉及一种T4噬菌体多核苷酸激酶(T4 bacteriophage polynucleotide kinase，T4 PNK)的可溶性表达及纯化方法。属生物化学领域。

背景技术

T4噬菌体多核苷酸激酶(T4 bacteriophage polynucleotide kinase，T4 PNK)，是一种多聚核苷酸5′羟基激酶，可以催化ATP的？位磷酸基团向单链或双链DNA、RNA、寡核苷酸或带有3′磷酸基团的单核苷酸的5′羟基转移。其他NTP也可产生相同的反应：5′-OH+NTP？5′-P+NDP。T4Polynucleotide Kinase同时具有3′磷酸酯酶活性，可催化3′磷酸化的多聚核苷酸的去磷酸化：3′-P？3′-OH+Pi。T4噬菌体多核苷酸激酶应用广泛，如寡核苷酸、DNA或RNA的5′末端标记，用作Southern、Northern、EMSA等的探针，凝胶电泳的marker，DNA测序引物，PCR引物等；使寡核苷酸、DNA或RNA的5′端磷酸化，确保后续连接反应顺利进行。作为常用的分子生物学产品，T4噬菌体多核苷酸激酶市场需求量大，目前基因工程技术克隆的重组T4噬菌体多核苷酸激酶在pET系统中表达量高，但是容易形成包涵体，纯化后只能得到少量的活性蛋白。

发明内容

本发明的目的是为克服上述技术的不足之处，提供一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶在大肠杆菌中可溶性表达及纯化方法。本发明通过载体构建将T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下T4噬菌体多核苷酸激酶与GST融合表达，T4噬菌体多核苷酸激酶蛋白表达量可以达到15％，可溶性达到95％。

本发明是以如下技术方案实现的：一种重组T4噬菌体多核苷酸激酶，其特征在于的T4噬菌体多核苷酸激酶的核苷酸序列如序列表SEQ IF NO：1所示。

其制备方法包括如下步骤：通过载体构建将密码子优化的T4噬菌体多核苷酸激酶基因克隆到pGEX载体中，在低温条件下通过与GST融合表达，来提高蛋白表达量和可溶性；T4噬菌体多核苷酸激酶基因序列如序列表SEQ ID NO：1所示；T4噬菌体多核苷酸激酶与GST在宿主菌中融合表达，融合表达蛋白为GST-T4 PNK；融合表达蛋白含有GST标签，用GST柱子纯化融合蛋白。

进一步的，载体构建步骤具体为如下步骤：

引物设计如下：

所用正向引物为：5’-CATGGGATCCATGAAGAAAATCATT-3’；下划线部分为BamHI的酶切位点；

所用反向引物为：5’-CATGCTCGAGTCAAAAGTCCCCACTAG-3’；下划线部分为XhoI的酶切位点；

以合成的T4 PNK为模板，用PCR的方法扩增T4 PNK编码序列，PCR反应条件为：94℃热变性1分钟，55℃退火1min，72℃延伸90秒，共进行25个循环；纯化的PCR产物用BamHI和XhoI进行双酶切，然后插入pGEX的多克隆位点；对融合蛋白表达载体pGEX-T4 PNK进行DNA测序，分析其阅读框和编码序列的正确性。

进一步的，融合表达步骤具体为如下步骤：

分别将融合蛋白表达载体pGEX-T4PNK和对照载体pGEX转入表达宿主菌Escherichiacoli BL21(DE3)，挑取单克隆接种至新鲜的含50mg/l氨苄青霉素的LB培养基；待细菌长至OD₆₀₀为0.6左右，分别加入终浓度为0.6mM的IPTG诱导T4PNK的表达；将诱导过程中的温度设定为15°，诱导两个小时后收集菌体。

进一步的，纯化融合蛋白步骤具体为如下步骤：