[发明专利]一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用

权利要求书

1.一种苯丙氨酸脱氨酶基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的苯丙氨酸脱氨酶。

3.携带权利要求1所述基因的载体、重组细胞或基因工程菌。

4.一种获得权利要求1所述基因的方法，其特征在于，以粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的cDNA，最终获得全长基因序列。

5.一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的基因工程菌，其特征在于，将苯丙氨酸脱氨酶基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21，筛选获得阳性菌株。

6.一种表达权利要求1所述苯丙氨酸脱氨酶基因的方法，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)为表达载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将编码丙氨酸脱氨酶的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21后诱导表达该基因。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将带有pET-28a(+)-pal的重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM，于24℃培养12h后离心收集菌体；用含有10mM的咪唑、150mM氯化钠、pH7.5的50mM的磷酸缓冲液洗涤，然后超声波破碎细胞后离心收集上清；上清用带有His标签的亲和层析柱纯化，用含250mM咪唑、150mM NaCl、pH7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白；将收集的目的蛋白脱盐得到纯化后的PAL。

9.权利要求2所述苯丙氨酸脱氨酶在生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。

10.权利要求5所述基因工程菌在生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸中的应用。