[发明专利]一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

苯丙氨酸脱氨酶(PAL)在pH8.0时催化L-苯丙氨酸(L-phe)脱氨生成反式肉桂酸和氨，pH11.0时能催化逆向反应合成L-phe，工业上利用这一特性，生产人体必须氨基酸L-phe和甜味剂阿斯巴甜。PAL广泛存在于植物、微生物中，微生物主要有霉菌和酵母菌，尤其是红酵母属中。其中粘红酵母(Rhodotorula glutinis)可以在廉价的原料如玉米粉，糖浆，糖蜜，豆粕，味精废水等工业废料上生长，容易实现大规模的培养，已经成功应用于食品、制药等工业领域。但是由于该酶是诱导酶，在对数生长期酶活达到峰值后，酶活下降较快，稳定性差。

为进一步提高酶活和稳定性，需要采用分子生物手段对酶进行分子改造，但到目前为止，仅仅获得PAL的部分cDNA，缺少5'端的基因序列。由于该基因的5'端序列的GC含量高，容易形成发夹结构，传统的反转录很难成功。

为此，本发明提供了一种粘红酵母PAL全长的基因序列，经表达，获得4.2U/mg PAL。

发明内容

本发明的目的是提供一种粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述苯丙氨酸脱氨酶基因是以工业生产用菌株粘红酵母为出发菌株，分离其总RNA，反转录获得苯丙氨酸脱氨酶的cDNA，最终获得全长为2121bp的基因序列，编码706个氨基酸，酶活达到4.2U/mg，是目前已报到的最高酶活。

苯丙氨酸脱氨酶基因编码的苯丙氨酸脱氨酶可用于催化生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种表达所述苯丙氨酸脱氨酶的基因工程菌。优选以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21。

本发明要解决的第三个技术问题是提供一种表达所述基因获得苯丙氨酸脱氨酶的方法。优选以大肠杆菌为宿主，以pET-22b(+)、pET-23(+)、pET-28a(+)或pET-20b(+)为表达载体。进一步优选将获得的基因与载体pET-28a(+)连接，构建重组表达载体pET-28a(+)-pal，转化E.coli BL21后诱导表达该基因。

所述方法进一步优选将带有pET-28-pal的重组大肠杆菌培养至OD₆₀₀为0.6时加入诱导剂IPTG至终浓度0.4mM，于24℃培养12h后离心收集菌体，用含有10mM的咪唑、150mM氯化钠，pH7.5的50mM的磷酸缓冲液洗涤2次，然后采用超声破碎细胞30min后离心收集上清，上清用带有His标签的亲和层析柱纯化，用含250mM咪唑、150mM NaC，pH7.5的磷酸缓冲液进行洗脱，收集目的蛋白。将收集的目的蛋白用脱盐柱脱盐得到纯化后的PAL。

本发明提供了一种完整的新的粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶基因，编码的苯丙氨酸脱氨酶酶活达到4.2U/mg，是目前已报到的最高酶活。该基因的获得为进一步利用分子生物学手段对酶进行改造，以提高酶活及其稳定性提供了基础。所得苯丙氨酸脱氨酶及相应基因工程菌都可以应用于生产L-苯丙氨酸或反式肉桂酸。

附图说明

图1为粘红酵母总RNA的电泳图。

图2为反转录后PCR扩增全长基因的电泳图。

图3为粘红酵母苯丙氨酸脱氨酶的阅读框及翻译的氨基酸序列。

图4为重组酶的表达；M，蛋白marker；1，不带重组质粒pET-28-pal的E.coil BL21全细胞电泳；2，带重组质粒pET-28-pal，未用IPTG诱导的E.coil BL21全细胞电泳；3，带重组质粒pET-28-pal，IPTG诱导的E.coil BL21全细胞电泳。

图5SDS-PAGE检测纯化的蛋白；M，为蛋白marker；1，全细胞电泳；2，采用His纯化柱纯化后获得的PAL。

图60.5mM反式肉桂酸标样的HPLC图(出峰时间为6.35min)。

图7重组酶催化L-苯丙氨酸后HPLC分析(在6.25min出现产物峰，与标样出峰时间一致)。

具体实施方式

实施例1 提取粘红酵母总RNA