[发明专利]一种环丙烷甲酸酯水解酶、基因、突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种环丙烷甲酸酯水解酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达载体及重组表达转化体，该重组环丙烷甲酸酯水解酶的制备方法，以及该环丙烷甲酸酯水解酶用于拆分制备(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酸的方法。

背景技术

(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸[(S）-(+)-2，2-dimethylcyclopropanecarboxylic acid，(S）-(+)-DmCpCa]，分子式：C₆H₁₀O₂，分子量：114.14，沸点：100℃/12mmHg，CAS号为14590-53-5。（S）-(+)-DmCpCa是药物西司他汀的重要手性中间体。西司他汀(Cilsatatin)是一种由美国默克(Merck)公司开发的肾脱氢二肽酶抑制剂，其本身并无抗菌效果，仅仅是一种特异性的酶抑制剂，与药物亚胺培南组合使用；亚胺培南(Imipenem)是一种β-内酰胺类抗生素，具备高效的抗菌活性，但易于被肾脱氢二肽酶所破坏。临床试验证明，当亚胺培南单独给药时，经肾小球过滤、分泌作用后，位于近端的肾小管上皮细胞中的肾脱氢二肽酶会催化其水解而使其活力损失约60～95％，从而导致活性药物浓度的降低。当西司他汀与亚胺培南两者组合使用后，西司他汀可以抑制肾脱氢二肽酶的活力，进而有效地降低肾脱氢二肽酶对亚胺培南的水解作用，使得亚胺培南的AUC(24h内稳态血药浓度-时间曲线下的面积)增加20％，在尿液中回收的活性药物高达70％。因此市售的药物是由西司他汀与亚胺培南按1∶1的比例制成的复合制剂一泰能(Tienam)。泰能是第一个成功应用于临床的新型碳青霉烯类抗生素，特别适用于由多种病原体所致疾病以及需氧/厌氧菌共同引起的混合感染，这些病原体/细菌通常对氨基糖甙类、头孢菌素类以及青霉素类抗生素产生耐药性，而对碳青霉烯类抗生素比较敏感。目前泰能是用于重症感染的首选药物，同时也是全球畅销药物之一。

(S）-(+)-DmCpCa的生产方法包括两大类：化学不对称合成法和外消旋体拆分法，其中拆分法又包括化学法拆分与生物法拆分两种。与化学法相比，生物拆分法具有反应条件温和、环境友好、产物光学纯度高等优点，更适合于工业应用。

采用生物拆分法制备(S）-(+)-DmCpCa及其衍生物，一般采用的是水解酶。根据不同类型的水解酶催化底物的结构差异，用于拆分的底物可分为三类：2，2-二甲基环丙烷甲腈、2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和2，2-二甲基环丙烷甲酸酯。王梅祥等应用Rhodococcus sp.AJ270催化2，2-二甲基环丙烷甲腈非对映选择性水合生成酰胺，后者可被进一步对映选择性水解，生成(S)-(+)-DmCpCa。当底物2，2-二甲基环丙烷甲腈浓度为20mM时，30℃反应3h后获得(S）-(+)-DmCpCa的ee值为82％，产率为39％(J.Mol.Catal.B：Enzymatic2002，18：267-272)。瑞士Lonza公司以2，2-二甲基环丙烷甲腈为拆分底物，底物浓度为300mM，先由含有腈水合酶的整细胞催化2，2-二甲基环丙烷甲腈水合生成2，2-二甲基环丙烷甲酰胺(欧洲专利，公开号EP 0524604；美国专利，公开号US 5427934)，后者又进一步地被细胞内的酰胺酶选择性的水解，最终产物为(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺和(R)-DmCpCa。该方法中产物(S）-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺最终得率为35％，ee值大于98％。这两种方法均以腈为底物，反应的绿色安全性较低。郑裕国等从土壤中筛选得到两株产(R)-酰胺酶的微生物菌株，一株为Delftia tsuruhatensis CCTCC205114，细胞经固定化后，催化10mM的2，2-二甲基环丙烷甲酰胺水解，在pH8.5、35℃条件下反应40min，得到(R)-(-)-DmCpCa的产率为49.5％，ee值＞99％，剩余(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率＞49％，ee值为97.7％(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.2010，37：503-510)；另一株为Brevibacterium epidermidis CCTCC207076，使用整细胞作催化剂，在底物浓度10mM，pH7.4、35℃下反应70min，剩余(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酰胺的得率为41.1％，ee值＞99％(J.Appl.Microbiol.2008，105：1150-1157)。如果以2，2-二甲基环丙烷甲酸酯为底物，操作步骤简单，而且成本较低。王普采用固定化脂肪酶Novozyme435对映选择性水解2，2-二甲基环丙烷甲酸乙酯(DmCpCe)制备(S）-(+)-DmCpCa，当酶量为16g/L时，转化65mM底物需要64h，产物得率为45.6％，ee值为99.2％。而后他们利用亲水性离子液体作为反应介质虽可将底物浓度提高至100mM，反应时间缩短12h，但由于商品化的Novozyme435价格偏高，并且酶的活力相对较低，重复使用后酶的活性及选择性也有所下降，因此难以满足工业要求(Chin.J.Catal.2010，31：651-655；中国发明专利，公开号CN102559833 B)。刘朝红以2，2-二甲基环丙烷甲酸酯为底物进行野生菌的筛选，发现Rhodococcus sp.ECU1013能够选择性地水解底物生成(S）-(+)-2，2-二甲基环丙烷甲酸，两相反应中底物浓度为400mM，反应120h，最终产物的收率为38％，ee_p为99％(Appl Microbiol Biotechnol.2013，97：7659-7667；中国发明专利，授权公开号CN 102757924 B)。