[发明专利]检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列

说明书

本申请是申请日为2007年9月20日、发明名称为“检测稀有循环细胞内多种信号转导分子的基于抗体的阵列”的中国专利申请200780042849.3(国际申请号PCT/US2007/079002)的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2006/9/21提交的美国专利申请号11/525,598(该申请已变为美国临时专利申请No.____)和2007/8/20提交的美国临时申请号60/913,087的优先权，出于所有目的将它们的内容通过引用全文纳入本文。

发明背景

经常在癌症不同早期阶段的患者血液内发现“微小转移”肿瘤细胞(散布肿瘤细胞)，在转移癌中也有发现。血液中肿瘤细胞的数目取决于肿瘤的阶段和类型。肿瘤是极其异质性的。因此，单个部位的活检样品可能无法代表肿瘤群的异质性。活检样品通常从原发性肿瘤上获得；然而，无法对大多数转移瘤进行活检，从而更难于对肿瘤样品进行分子分析。

在肿瘤转移期间，最具攻击性的肿瘤细胞离开原发性肿瘤并经血液和淋巴系统到达远端位置。因此，血液中的循环肿瘤细胞是肿瘤细胞中最具攻击性和同质性的群体。每毫升血液中转移肿瘤细胞的数目可从一个到几千个。因此，需要特异且灵敏的方法为诊断和预后目的来检测这些细胞。本发明满足了这一需要并提供了有关优点。

发明概述

本发明提供了用于检测稀有循环细胞内众多信号转导分子的活化状态和/或总量的基于抗体的阵列以及其用法，其优点在于具有酶联免疫吸附试验的特异性、信号放大的灵敏性以及微阵列的高通量多重性。

一方面，本发明提供了一种具有高动态范围(superior dynamic range)的阵列，其包含细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上。

另一方面，本发明提供了一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：

(a)将细胞提取物与该细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列一起培育以形成众多捕获分析物，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上；

(b)将该众多捕获分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物；

(c)将该众多可检测的捕获分析物与信号放大对的第一和第二成员一起培育以产生放大信号；和

(d)检测由信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

在还有另一方面，本发明提供了一种进行具有高动态范围的多重、高通量免疫测定的方法，该方法包括：

(a)将细胞提取物与该细胞提取物中一种或多种分析物的特异性捕获抗体的众多稀释系列一起培育以形成众多捕获分析物，其中所述捕获抗体局限在固相支持体上；

(b)将该众多捕获分析物与相应分析物的特异性检测抗体一起培育以形成众多可检测的捕获分析物，其中该检测抗体包含：

(1)众多用易化部分(facilitating moiety)标记的活化状态非依赖性抗体，和

(2)众多用信号放大对的第一成员标记的活化状态依赖性抗体，

其中所述易化部分产生导向信号放大对的第一成员并与其反应的氧化剂；

(c)将众多可检测的捕获分析物与信号放大对的第二成员一起培育以产生放大信号；和

(d)检测由该信号放大对的第一和第二成员产生的放大信号。

本发明还提供了进行上述基于抗体的阵列方法的试剂盒，其包含：(a)局限在固相支持体上的众多捕获抗体的稀释系列；和(b)众多检测抗体。该试剂盒还任选包含诸如信号放大对的第一和第二成员等其他试剂。

通过以下详述和附图，本领域技术人员能明白本发明的其它目的、特征和优点。

附图简述

图1显示了特异性结合于活化分析物的三个抗体。

图2显示了试验过程，其中已经特异性结合于活化分析物的标记的抗体局限在固相支持体上。

图3显示了在ELISA中用抗EGFR胞外域单克隆抗体作为捕获抗体和检测抗体检测A431细胞中的总EGFR。(a)夹心ELISA标准曲线。采用人EGFR重组胞外域的灵敏度为约0.25pg/孔。(b)细胞滴定曲线。A431细胞内的EGFR浓度通过ELISA检测。(c)以pg/孔和pg/细胞计算出的总EGFR浓度。计算出的各A431细胞内的EGFR浓度为约0.6pg。