[发明专利]一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。

背景技术

聚乙二醇(PEG)是环氧乙烷水解产物的聚合物，为一种亲水、不带电荷的线性大分子。共价连接亲水性聚合物聚乙二醇是一种增加生物活性分子(包括蛋白、肽、尤其是疏水性生物分子)的水溶性、提高其生物利用度、延长血清半衰期、调节免疫原性、提高生物活性常用的方法。其中，利用PEG修饰蛋白质来延长其半衰期、减少免疫原性、增加稳定性，是一项已成功应用的技术。该技术已被广泛应用于蛋白质类药品的修饰，例如，已经上市的包括PEG-门冬酰胺酶，PEG-ADA(腺苷脱氨酶)，PEG-干扰素和PEG-GCSF(粒细胞集落刺激因子)等。其中PEG-干扰素由原来的每两天或每天注射一次降低到每周一次，而且疗效显著改善。PEG-GCSF也由每天注射一次改善为每个化疗疗程注射一次。

目前，对蛋白质进行PEG修饰的方法主要为化学修饰法，主要步骤包括：取活化的PEG，在偶联剂的作用下，PEG末端的羟基与蛋白质分子上的氨基、羧基或巯基等基团发生偶联作用，即得。因为蛋白质分子上多个基团可以与聚乙二醇发生反应，所以导致了在蛋白质的聚乙二醇化学修饰过程中会有一些副反应的发生，产生多个PEG修饰的蛋白质复杂混合物，并且有可能破坏所修饰蛋白的生物活性，最终导致所得的修饰产物不均一、副产物多、疗效不稳定，进而限制了PEG在蛋白质修饰中的应用。所以，急需提供一种蛋白质定点PEG修饰的方法，以获得产物单一、质量稳定的PEG修饰的蛋白质，推广PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种蛋白质定点PEG修饰的方法及所得PEG修饰的蛋白质。本发明提供的方法采用分选酶进行蛋白质PEG修饰，可以实现在蛋白质的C末端定点修饰上PEG，避免了蛋白质PEG修饰中副反应的发生，更有利于PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。

为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供了一种蛋白质定点PEG修饰的方法，包括以下步骤：

步骤1：获得蛋白质，在该蛋白质的C末端融合分选酶识别的分选基序，得重组蛋白质；

步骤2：取PEG修饰剂、步骤1制得的重组蛋白质，与分选酶混合，经肽键的切割、连接反应，获得PEG修饰的蛋白质；

步骤2中的PEG修饰剂具有式(I)所示结构：

其中，m为聚合度，1≤m≤5；n为聚合度；110≤n≤1100。

分选酶普遍存在于革兰氏阳性细菌中，是一类膜结合的巯基转肽酶，负责将表面蛋白锚定到细胞壁肽聚糖上。分选酶兼有蛋白酶和转肽酶活性，其催化的表面蛋白在N端和C端都有特征信号，N端含有信号肽，而C端的分选信号由分选基序、紧随其后的疏水区和带正电荷的尾部组成。本发明通过在蛋白质的C端偶联上分选酶特异性识别的分选基序，再加入带有游离的N端的PEG修饰剂，利用分选酶特异位点切割肽键、并将氮端带有两个以上甘氨酸的PEG修饰剂连接到被切割位点之上，形成新的肽键，即实现了在蛋白质的C末端定点修饰PEG，整个操作简单，成本低，避免了蛋白质PEG修饰时容易产生多位点修饰的发生，更有利于PEG修饰在蛋白质修饰中的应用。

优选地，本发明提供的方法中，步骤1中的分选酶为分选酶SrtA。本发明提供的方法步骤2中的分选酶SrtA催化的肽键的切割、连接反应过程中，分选酶SrtA先识别融合在蛋白质C末端的分选基序，“LPXTG”或“LPXAG”，并在“T-G”或“A-G”位点切割肽键，产生一个酰基中间产物，之后分选酶SrtA介导PEG修饰剂中游离的氨基，亲核进攻该酰基中间产物，形成新的肽键，即实现了将PEG定点修饰到蛋白质的C末端上，获得了定点PEG修饰的蛋白质。

优选地，本发明提供的方法中，步骤1中的蛋白质为生长激素；更为优选地，步骤1中的蛋白质为人生长激素，具有下述氨基酸序列中的任意一个：

(VIII)具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；

(IX)具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。

优选地，本发明提供的方法中，步骤1中分选基序具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

更为优选地，本发明提供的方法中，步骤1中分选基序为下述氨基酸序列中的任意一个：

(I)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；