[发明专利]基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用

权利要求书

1.一种基因重组TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16，其特征在于：编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1或2所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)设计并合成RMP16基因：

采用3条引物两步法合成RMP16基因：

引物F1：

5'-GGTGGTCATATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTG-3'；

引物F2：

5'-GCTCACCGCAATGCGGCTAATGGTATGGGTCAGCAGGCGACCTTC-3'；

引物F3：

5'-CCACCATGCTCTTCCGCACAGCAGATTCACTTTGGTCTGATAGCTCACCGCAAT-3'；

其中，CATATG为Nde Ⅰ酶切位点，GCTCTTCCGCA为Sap Ⅰ酶切位点；GGTGGT和CCACCAT为保护碱基；

首先将引物F1和引物F2进行链延伸反应，然后以其产物为DNA模板，以F1和F3为引物，PCR反应制得RMP16基因；

(2)构建重组载体pTXB1-RMP16：

用Ndel酶和Sapl酶分别对质粒pTXB1和步骤(1)制得的RMP16基因进行双酶切，再将双酶切后的RMP16基因和双酶切后的质粒pTXB1连接，得到重组载体pTXB1-RMP16；

(3)制备表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566：

用重组载体pTXB1-RMP16转化表达宿主菌大肠杆菌E.coli Strain ER2566，得到表达工程菌pTXB1-RMP16/ER2566；

(4)表达和纯化：

①诱导表达工程菌pTXB1-RMP16L/ER2566表达由目的多肽、蛋白内含肽和几丁质结合域组成的“三元”融合蛋白；

②得到的“三元”融合蛋白用几丁质柱进行纯化，“三元”融合蛋白吸附于几丁质柱中，然后含有β-巯基乙醇的溶液过柱并充满几丁质柱环境中，反应；β-巯基乙醇的作用是诱导蛋白内含肽的N端切割，释放目的多肽；然后用洗脱几丁质柱的溶液洗柱，收集洗脱液；

③利用高效液相色谱技术纯化目的多肽，得到基因重组TNF-α衍生物RMP16。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的链延伸反应的条件为：94℃，10min；60℃，5min；72℃，10min。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的PCR反应的条件为：94℃，5min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、30s，31次循环；72℃延伸10min。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)②中所述的反应的条件为23℃反应24小时。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)②中所述的含有β-巯基乙醇的溶液的组成如下：20mM Tris-HCI，0.5M NaCl，1mM EDTA，50mMβ-巯基乙醇，pH 8.0；

步骤(4)②中所述的洗脱几丁质柱的溶液的组成如下：20mM Tris-HCl，500mM NaCI，1mM EDTA，pH 8.0。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)③中所述的利用高效液相色谱技术纯化目的多肽RMP16的步骤如下：

A、流动相A为在体积百分比5％乙腈中添加三氟乙酸得到，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流动相B为100％乙腈中添加三氟乙酸，TFA的终浓度为体积百分比0.1％；流速1mL/min，30min线性梯度洗脱；

B、线性梯度洗脱中流动相B由体积百分比0～58％，收集目的多肽洗脱峰，光吸收检测波长为218nm；并进行质谱鉴定。