[发明专利]基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，特别涉及一种基因重组TNF-α衍生物RMP16及其制备方法与应用。

背景技术

TNF-α是较早发现的、研究最为深入的肿瘤坏死因子家族成员之一，抗肿瘤作用强，参与多种生理病理过程的调节。人TNF-α为单拷贝基因，定位在第六号染色体上(6P^12-13)，与MHC基因群紧密连锁；TNF-α的cDNA大小约2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成。人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，包括由第1、2号外显子编码的76个氨基酸残基的信号肽；切除信号肽后形成非糖基化的成熟的人TNF-α，为157个氨基酸残基，相对分子量为17kDa.。其中第69位和101位为两个半胱氨酸，可形成分子内二硫键，对维持其空间结构有重要意义。

TNF-α作为一种蛋白类因子，其生物学活性主要是通过和细胞膜上特异受体结合实现的。TNF-α有两种受体，一种是存在于大部分细胞表面的分子量为55-60kDa.的肿瘤坏死因子受体Ⅰ(tumor necrosis factor receptor Ⅰ，TNFR Ⅰ)，另一种是主要存在于造血细胞表面的分子量为75-80kDa.的肿瘤坏死因子受体Ⅱ(tumor necrosis factor receptor Ⅱ，TNFR Ⅱ)。两类TNFR均为跨膜糖蛋白，氨基酸序列分析显示这两种受体的胞外结构域的序列高度相似，都有保守的富含半胱氨酸的同源氨基酸序列；但是胞内结构域却差异很大，TNFR Ⅰ胞内段含有死亡结构域(death domain，DD)，而TNFR Ⅱ没有DD。TNFR Ⅰ在大多数种类细胞的表面都表达，且大部分生物学功能是由TNFR Ⅰ介导，包括杀细胞、抗病毒、诱导ICAM-1及IL-6的表达、促进成纤维细胞增殖、激活NF-κB等。TNFRII主要传递胸腺细胞和NK细胞等淋巴细胞的增殖信号，通过促进TNF-α与TNFR Ⅰ结合而增加TNFR Ⅰ诱导的作用。根据细胞及其微环境的不同，激活TNFR Ⅰ后可通过激活不同的信号途径介导细胞增殖、凋亡、坏死性凋亡等程序。

TNF-α具有很好抗肿瘤作用，被认为是最具潜质的癌症治疗药物。但TNF-α在体内易被肾快速排泄和被各种蛋白酶分解，很不稳定，半衰期较短(15-30min)。若希望达到疗效，则必须频繁注射大剂量TNF-α，进而导致严重的不良反应，甚至引起休克死亡。TNF-α的上述缺陷，严重限制了其实际临床应用，

研究表明，小分子多肽具有分子量小、活性高、副作用小、无免疫原性、结构简单、易于穿透肿瘤细胞等特点，已成为肿瘤药物研发的新热点。这些都预示着小分子TNF-α衍生物在临床方面将有良好的应用前景。设计高稳定性、高生物活性的TNF-α衍生物，特别是能与血浆中的载体蛋白结合的小分子TNF-α衍生物，可提高其生物利用度，发挥天然TNF-α抗肿瘤的同时，也极大降低了天然TNF-α具有的副作用。具有重要的药用价值和产业化前景。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种基因重组TNF-α衍生物RMP16。该衍生物RMP16具有更高稳定性和更高生物活性。

本发明的另一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法。该制备方法根据TNF-α衍生物RMP16的氨基酸序列及大肠杆菌密码子的偏好性，设计RMP16在原核表达系统的基因序列，采用基因工程技术，结合蛋白内含肽(intein)的可诱导剪切功能实现目的多肽RMP16的高效制备；该制备方法生产效率高，生产成本低。

本发明的再一目的在于提供所述基因重组TNF-α衍生物RMP16的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基因重组TNF-α衍生物RMP16，其氨基酸序列如下所示：MWQRPSSWIEGRLLTHTISRIAVSYQTKVNLL。

编码所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的核苷酸序列为：

ATGTGGCAGCGCCCGAGCAGCTGGATTGAAGGTCGCCTGCTGACCCATACCATTAGCCGCATTGCGGTGAGCTATCAGACCAAAGTGAATCTGCTG；

所述的基因重组TNF-α衍生物RMP16的制备方法，包括以下步骤：

(1)设计并合成RMP16基因：

采用3条引物两步法合成RMP16基因：

引物F1：