[发明专利]逆转肿瘤多药耐药的基因组合物h‑R3/PAMAMG5/MDR1siRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种逆转肿瘤多药耐药的基因组合物-h-R3/PAMAM G5/MDR1 siRNA及其应用。

背景技术

恶性肿瘤是常见且严重威胁人类健康和生命的重大疾病之一，正在成为世界“头号杀手”。随着抗肿瘤新药的不断研发，化疗方案的不断改进，化疗在肿瘤综合治疗中的作用和地位日益重要。但是，抗肿瘤化学药物的选择性低、对正常组织毒副作用大，这些因素很大程度上影响临床化疗的效果。除此之外，肿瘤细胞多药耐药的产生也成为目前肿瘤化疗失败的一个主要原因，据美国癌症协会估计，90％以上肿瘤患者死于不同程度的耐药。因此，如何成功逆转肿瘤多药耐药也已成为目前肿瘤治疗领域中亟待解决的重要问题[van Vlerken et al.,2008]。

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现耐药性的同时，对结构和作用机制不同的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药性，从而大大降低了抗肿瘤药物的疗效。MDR形成机制复杂，肿瘤细胞可以通过不同途径导致MDR的产生。

随着肿瘤细胞MDR分子机制研究的不断深入，克服MDR的方法研究也取得了较大进展，目前研究较多的是化学合成抑制剂和基因治疗。化学合成的抑制剂能够增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，但这些药物在临床应用中特异性不高、毒副作用严重，难以达到逆转MDR的有效血浆浓度，并且肿瘤细胞也可以对这些药物产生耐药性，其临床应用受到限制。目前逆转肿瘤多药耐药的基因治疗方法主要集中在：1)抑制P-gp药泵功能(Lin et al,2003)；2)干扰MDR相关基因的表达，如MDR1基因的反义寡聚脱氧核糖核酸(AOD)，MDR1和MRP基因的反义RNA联合抑制，切割MDR1mRNA的核酶(Stuart et al 2000；Wang et al,2003；Huesker et al,2002)；3)针对MDR1基因调节的基因治疗(Efferth et al,2001)；4)mdr1/siRNA的RNA干扰(Hannon et al,2002；Yague et al,2004)。与反义寡核苷酸、反义RNA和人工转录因子相比，siRNA的应用前景最好，其它均存在体内特异性不强、转染效率和稳定表达不足等问题。

尽管siRNA相比于反义寡核苷酸、反义RNA等具有较好的应用前景，但具有核酸和小分子化合物的双重特性的siRNA，其本身的亲水性和阴离子特性使其很难通过细胞膜，而且由于易被核酸酶(RNase)降解导致其具有稳定性差、半衰期短、转染效率低等特点。因此应用siRNA分子的关键是如何使其有效地穿过细胞膜，进入细胞质中的RNAi通路。而且将siRNA分子导入生物体内治疗疾病更为复杂，除了细胞膜障碍外，还要克服靶细胞的选择性、体内siRNA分子的稳定性、动态平衡的机制以及对非靶细胞的毒性等问题。因此，siRNA是否能够有效递送是其能否应用于临床的关键，设计和合成安全、高效、靶向的siRNA递送载体已经成为目前siRNA药物研究的重要方向。

新型树枝状高分子聚酰胺-胺(PAMAM)，以其独特的分子结构和表面性质，成为了治疗性基因载体研究的热点。以末端为胺基的PAMAM树枝状大分子为例，它在生理pH条件下具有很好的溶解性，其正电性的特征可以实现更多数量基因的运载，而且体系稳定，能够保护目的基因不受体内血浆或组织细胞中各种酶的破坏，因而可以实现体内的有效转染[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:4897-4902]。但PAMAM作为基因递送载体在体内应用尚存在以下几个问题需要解决：1)转染效率相对较低；2)在体内环境下，PAMAM可以非特异性的结合大量的负电大分子和红细胞，影响转染效率并且发生溶血现象；3)如何实现PAMAM纳米基因递送系统的靶向性。

为了解决上述问题，目前研究多直接在PAMAM分子上进行修饰，如在PAMAM表面修饰鸟氨酸等残基[Int J Pharm,2010,392:294–303]，增强PAMAM分子表面正电性以增强转染效率，但此方法在增强过多正电性的同时，也提高了细胞毒性；另一方面，对PAMAM表面修饰PEG[Nanotechnology,2009,20:105-103]，以提高生物相容性，减少非特异性的结合血浆中的负电大分子和红细胞，另外，在PEG末端修饰特定蛋白如乳铁蛋白[Biomaterials,2008,29(2):238-246]，以实现组织靶向性，但PEG的修饰增加了PAMAM分子和DNA分子结合的空间位阻，降低了转染效率。