[发明专利]用于检测NK细胞活性的试剂盒

权利要求书

1.一种用于检测NK细胞活性的方法，包括步骤：

(1)取3ml肝素钠抗凝的外周血与PBS缓冲液按照1:1稀释，将稀释后的标本缓慢注入具有2ml淋巴细胞分离液的10ml离心管中，以665g转速离心20min，吸取中间白细胞层；采用PBS清洗2次，然后以393g转速离心10min，去上清液；将500μl RPMI1640培养液加入离心得到的沉淀中，混匀，得到单个核细胞PBMNC，浓度调节为1*106/ml备用；

取对数期的K562-EGFP细胞用PBS洗2次，然后以393g转速离心10min，去上清液，加500μl RPMI1640培养液混匀，放室温静置1h，浓度调节为1*105/ml备用；

(2)将100μl K562-EGFP加入对照管中；将100μl PBMNC+100μl K562-EGFP加入检测管中；然后将对照管与检测管均放入5％CO2培养箱中孵育2h；

(3)将5.520μl抗体7-AAD-percp-cy5.5加入对照管与检测管中，充分混匀，静置1分钟，然后采用流式细胞仪检测细胞活性。

2.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的方法，其特征在于，在采用流式细胞仪检测细胞活性前需要调整其电压，调整电压的步骤为：将100μl PBMNC加入A管中；将100μl PBMNC与100μl K562-EGFP加入B管中，然后将A管与B管均放入5％CO2培养箱中孵育2h；将5.520μl7-AAD-percp-cy5.5加入A管中，充分混匀，静置1分钟。

3.根据权利要求1所述的一种用于检测NK细胞活性的方法，其特征在于，对照管与检测管中细胞的流速限制在200-800个/s，收集P1门内细胞至少10000个。

4.根据权利要求1至3中的一个所述的一种用于检测NK细胞活性的方法，其特征在于，在采用流式细胞仪检测得到的结果中，对照管中Q2门内细胞代表K562-EGFP细胞在试验过程中自身凋亡的细胞数，Q2+Q4门内细胞代表K562-EGFP细胞总数，Q2/(Q2+Q4)代表自身K562-EGFP凋亡比例，采用A表示；检测管中Q2门代表被NK细胞杀伤及自身凋亡的K562-EGFP细胞总数，Q2/(Q2+Q4)代表总的K562-EGFP凋亡比例，采用B表示；

检测出的NK细胞活性＝100*(B-A)％。

5.根据权利要求4所述的一种用于检测NK细胞活性的方法，其特征在于，正常人NK细胞活性在3.9％至19.5％，当检测出的NK细胞活性与正常人NK细胞活性两者之差小于3.9％时，检测结果为NK细胞活性降低；当两者之差大于19.5％时，检测结果为NK细胞活性增强。

6.一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其用于实施权利要求1-5中任一项所述的方法，所述试剂盒包括盒体、盒盖和设置在盒体内的衬垫，所述衬垫上设有小孔，装有PBS缓冲液的试剂管、装有淋巴细胞分离液的试剂管、装有RPMI1640培养液的试剂管、装有荧光染料EGFP的试剂管、装有抗体7-AAD-percp-cy5.5的试剂管、装有荧光染料的载体pEGFP-N1质粒的试剂管被设置在所述小孔内。