[发明专利]用于检测NK细胞活性的试剂盒

说明书

技术领域

本发明型属于生物技术领域，涉及一种用于检测NK细胞活性的试剂盒。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，其发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境。NK细胞的功能主要是通过一下方式实现的。NK细胞自然杀伤活性：NK细胞识别靶细胞(某些肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞、寄生虫等)，接着NK细胞释放穿孔素，细胞毒因子，活化的NK细胞释放TNF因子，从而达到裂解和杀伤靶细胞的可能。NK细胞毒作用(ADCC效应)，主要是NK细胞表面具有FcγRⅢA，主要结合人IgG1和IgG3的Fc段(Cγ2、Cγ3功能区)，在针对靶细胞特异性IgG抗体的介导下可杀伤相应靶细胞。活化的NK细胞可合成和分泌多种细胞因子，发挥调节免疫和造血作用以及直接杀伤靶细胞的作用。NK细胞通过自然杀伤和ADCC发挥的细胞毒作用，在机体抗病毒感染、免疫监视中起重要作用。

目前，NK细胞活性检测方法主要有形态法、酶释法、荧光法、放免法，这些诊断、检测方法的优缺点如下：形态法的方法简便，易于掌握，但判断死细胞与活细胞不免带有检测者的主观因素，也无法计数轻微损伤的细胞。酶释法的成本低、快速简便，可定量。缺点是靶细胞内碱性磷酸酶含量低或因某些未死亡细胞能自行释放，从而影响法灵敏度和特异性。此外乳酸脱氢酶分子较大，仅当靶细胞膜完全被破坏时才释放，故不能较早地反映效应的功能。荧光分析法常遇细胞自然释放率高，荧光本底强，影响灵敏度。放免法的操作简便快速能定量，缺点是自然释放率高，所需靶细胞数量多，半衰期短。

因此临床急需一种检测速度快且灵敏度高的检测技术，更有利于患者的及时诊治。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测NK细胞活性的试剂盒，其能节约检测时间和检测成本，且灵敏度高。

为实现上述目的，在本发明的第一个方面，本发明提供了一种用于检测NK细胞活性的方法，包括步骤：(1)首先制备细胞：取3ml肝素钠抗凝的外周血与PBS缓冲液按照1:1稀释，将稀释后的标本缓慢注入具有2ml淋巴细胞分离液的10ml离心管中，以665g转速离心20min，吸取中间白细胞层；采用PBS清洗2次，然后以393g转速离心10min，去上清液；将500μl RPMI1640培养液加入离心得到的沉淀中，混匀，得到单个核细胞(PBMNC)，浓度调节为1*106/ml备用；取对数期的K562-EGFP细胞用PBS洗2次，然后以393g转速离心10min，去上清液，加500μl RPMI1640培养液混匀，放室温静置1h，浓度调节为1*105/ml备用；(2)将100μl K562-EGFP加入1号管(对照管)中；将100μl PBMNC+100μl K562-EGFP加入2号管(检测管)中；然后将1号管与2号管均放入5％CO2培养箱中孵育2h；(3)将5.520μl抗体7-AAD-percp-cy5.5加入1号管与2号管中，充分混匀，静置1分钟，然后采用流式细胞仪检测细胞活性。

其中，在采用流式细胞仪检测细胞活性前需要调整其电压，调整电压的步骤为：将100μl PBMNC加入A管中；将100μl PBMNC与100μl K562-EGFP加入B管中，然后将A管与B管均放入5％CO2培养箱中孵育2h；将5.520μl7-AAD-percp-cy5.5加入A管中，充分混匀，静置1分钟。

其中，被测1号管与2号管中细胞的流速限制在200-800个/s，收集P1门内细胞至少10000个。

其中，采用流式细胞仪检测得到的结果中，对照管中Q2门内细胞代表K562-EGFP细胞在试验过程中自身凋亡的细胞数，Q2+Q4门内细胞代表K562-EGFP细胞总数，Q2/(Q2+Q4)代表自身K562-EGFP凋亡比例，采用A表示；检测管中Q2门代表被NK细胞杀伤及自身凋亡的K562-EGFP细胞总数，Q2/(Q2+Q4)代表总的K562-EGFP凋亡比例，采用B表示；NK细胞活性＝100*(B-A)％。

其中，正常人NK细胞活性在3.9％至19.5％，当两者之差小于3.9％时，结果为NK细胞活性降低；当两者之差大于19.5％时，结果为NK细胞活性增强。