[发明专利]基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法

权利要求书

1.一种纤维素代谢通路关键酶的工程菌，其特征在于，该工程菌为通过全基因合成获得的外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的重组过表达菌株；

所述的纤维素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶，其中：外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EX，如SEQ ID No.1所示，内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EN，如SEQ ID No.2所示，β‐1,4‐葡萄糖苷酶的核苷酸序列BG，如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日。

3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的全基因合成是指：通过对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E.coli K12，回避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。

4.一种根据权利要求1～3中任一所述的工程菌的实现方法，其特征在于，以灰略红链霉菌基因组DNA经过全基因合成构建得到的pUC57‐EX、pUC57‐EN和pUC57‐BG载体为模板，分别与对应含有酶切位点的引物进行PCR扩增并对应分别得到编码外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EX、编码内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EN和编码β‐1,4‐葡萄糖苷酶的核苷酸序列BG；然后将扩增得到的序列EX和EN依次连接到共表达载体pACYCDuet‐1、将扩增得到的序列BG连接到重组表达载体pET‐22b(+)，最终得到重组共表达载体pETDuet‐EX‐EN和重组表达载体pET‐22‐BG；之后将重组共表达载体pETDuet‐EX‐EN与重组表达载体pET‐22‐BG先后转化到大肠杆菌表达菌株内，获得转基因共表达菌株。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位点的引物包括：

EX‐Nco I‐F:TACCATGGCTGCTGTTCCGTGCACCGTTGACTACA

EX‐BamH I‐R:CGGGATCCTTAATGATGATGATGATGATGAGAAACCGGCGGGTAAGCG

EN‐Nde I‐F:TACATATGGACACCACCCTGTGCGAAGAATTCGGT

EN‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCGGTACGGCAAGCGGTA

BG‐Msc I‐F:GATGGCCATGGTGACCATCGACTACGCTGCTCTGC

BG‐Xho I‐R:CCCTCGAGTTAATGATGATGATGATGATGAGCAGCTTCACGAACACGT。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增的条件为：98℃预变性3min；98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸15s；30个循环后72℃终延伸3min。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征是，所述的大肠杆菌表达菌株为Transetta(DE3)大肠杆菌。

8.一种根据上述任一权利要求所述的纤维素代谢通路关键酶的工程菌的应用，其特征在于，将其用于外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶的体外高效表达，并最终实现纤维素的原位快速降解。