[发明专利]基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质纤维素是植物界中最为丰富的天然高分子化合物，是植物通过光合作用产生的主要干物质，主要包括纤维素、半纤维素和木质素。据估计，每年全世界绿色植物光合作用产生的木质纤维素总干重为l730亿t，所含总能量高达2×10¹⁸KJ，相当于每年全世界消耗能量的10倍。木质纤维素的生物降解和解聚作用是一个高度复杂的过程，涉及众多酶系的参与。 

木质纤维素中的纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，性质稳定。纤维素降解需要纤维素酶的参与，而纤维素酶并不是一种简单的酶，是由若干种相互关联的酶组成的一个复杂的酶系，主要由3类组成：内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶(Endo‐β‐1,4‐glucanase)，称为Cx酶；外切葡聚糖酶(EXo‐β‐1,4‐glucanase)，称为C1酶；β‐葡萄糖苷酶(β‐glucosidase)，称为BG酶或CB酶。目前普遍接受的观点是3种酶协同作用于纤维素的降解过程，即首先由Cx酶在纤维素聚合物的内部起作用，在纤维素的非结晶部位进行切割，产生新的末端，然后再由外切葡聚糖酶以纤维二糖为单位，从末端进行水解，最后由CB酶将纤维二糖彻底水解为葡萄糖。因此，对于实现纤维素的快速彻底水解上述三种酶是缺一不可的。 

已证实，自然中的细菌、真菌乃至放线菌均具有上述三种纤维素酶的合成能力。与真核生物相比，原核生物具有生长速度较快，且基因无内含子，具有易克隆、易表达等优势。链霉菌作为土壤中常见的一类细菌(放线菌)，对多数高分子化合物具有较强的分解能力并在碳循环中起至关重要的作用。其中灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1经证实具有很强的纤维素分解能力。 

发明内容

本发明针对现有技术中外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶在灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)内多为诱导表达且表达水平很低的缺陷，提出一种基于纤维素代谢通路关键酶的工程菌及其实现方法，通过全基因组测序分析，从该链霉菌基因组分离到与纤维素降解有关的基因序列，其中包括编码外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶的基因序列。本发明通过对灰略红链霉菌内相关基因(GC含量70％以 上)进行序列优化后进行全基因合成，并将目的基因序列插入到共表达载体中，最终实现纤维素降解关键酶的体外共表达。本发明对灰色链霉菌内纤维素降解通路的研究乃至实现纤维素的快速降解均具有重要意义。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种纤维素代谢通路关键酶的工程菌，该工程菌为通过全基因合成获得的外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的重组过表达菌株。 

所述的纤维素代谢通路关键酶是指灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶。 

所述的外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EX，如SEQ ID No.1所示，内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的核苷酸序列EN，如SEQ ID No.2所示，β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的核苷酸序列BG，如SEQ ID No.3所示；其中：外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的基因序列为1641bp，编码546个氨基酸；内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶的基因序列为1029bp，编码342个氨基酸；β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因的基因序列为1359bp，编码453个氨基酸。 

所述的全基因合成是指：通过对灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)外切‐β‐1,4‐葡聚糖酶、内切‐β‐1,4‐葡聚糖酶和β‐1,4‐葡萄糖苷酶基因序列进行优化，设定表达宿主为E.coli K12，回避Nde I、Nco I、BamH I、Xho I、Msc I和EcoR I酶切位点、同时避免序列中出现不依赖rho因子的转录终止子及核糖体结合位点。