[发明专利]基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种生物基因工程技术领域的基因及其工程菌株，具体是一种灰略红链霉菌的基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法。 

背景技术

木质素是由四种醇单体(对香豆醇、松柏醇、5‐羟基松柏醇、芥子醇)形成的一种复杂酚类聚合物。木质素是构成植物细胞壁的成分之一，具有联结强化细胞的作用。此外，木质素也是一种含许多负电集团的多环高分子有机物，对土壤中的高价金属离子有较强的亲和力。 

根据单体的不同，可将木质素分为3种类型：由紫丁香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(S‐木质素)，由愈创木基丙烷结构单体聚合而成的愈创木基木质素(G‐木质素)和由对‐羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对‐羟基苯基木质素(H‐木质素)。一般而言，木质素在裸子植物主要存在类型为愈创木基木质素(G)，双子叶植物主要含愈创木基‐紫丁香基木质素(G‐S)，单子叶植物则为愈创木基‐紫丁香基‐对‐羟基苯基木质素(G‐S‐H)。从植物学观点出发，木质素就是包围于管胞、导管及木纤维等纤维束细胞及厚壁细胞外的物质；从化学观点来看，木质素是由高度取代的苯基丙烷单元随机聚合而成的高分子，它与纤维素、半纤维素一起，形成植物骨架的主要成分，在数量上仅次于纤维素。木质素填充于纤维素构架中增强植物体的机械强度，利于输导组织的水分运输和抵抗不良外界环境的侵袭。 

木质素单体同时含有多种活性官能团，如羟基、羰基、羧基、甲基及其它侧链结构。其中羟基在木质素中存在较多，以醇羟基和酚羟基两种形式存在，而酚羟基的多少又直接直接影响木质素的物理和化学结构，如能反映出木质素的醚化和缩合程度，同时也能衡量木质素的溶解性能和反应能力；在木质素的侧链上，有对羟基安息香酸、香草酸、紫丁香酸、对羟基肉桂酸、阿魏酸等酯型结构存在，这些酯型结构存在于侧链的α位或γ位。在侧链α位除了酯型结构外，还有醚型连接，或作为联苯结构的碳‐碳联结。同酚羟基一样，木质素的侧链结构也直接关系它的化学特性。 

由于木质素的复杂结构，高分子量及高度疏水性，与纤维素与半纤维素相比，木质素的降解相对较难。已发现的木质素降解酶主要有3类：木质素过氧化物酶(Lignin peroxidase)、锰过氧化物酶(Manganese peroxidase)和漆酶(Laccase)，此外，还有一些辅助酶也参与木质素的降解如氯化物过氧化物酶(Chloro‐peroxidase)和芳基醇氧化酶(Aryl alcohol oxidase)。灰略红链霉 菌(Streptomyces griseorubens)作为一种广泛存在于土壤的细菌，具有很强的木质素降解能力并得到了研究者越来越多的关注。研究灰略红链霉菌降解木质素的分子机制，克隆关键木质素降解酶基因序列，对于开发新型木质素降解酶制剂进而实现木质素的快速降解具有重要意义。 

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于氯化物过氧化物酶的工程菌及其实现方法，通过本发明所述的方法能够高效表达一种克隆自灰略红链霉菌氯化物过氧化物酶，可以克服氯化物过氧化物酶在原始菌株内表达量较低等缺点，有助于解决肥料利用率较低等问题，此外对于实现土壤中铵盐的快速转化进而培肥土壤，最终实现精准农业具有重大意义。 

本发明是通过以下技术方案实现的： 

本发明涉及一种氯化物过氧化物酶的工程菌，该工程菌为外源表达氯化物过氧化物酶的大肠杆菌。 

所述的胞内氯化物过氧化物酶具体为灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1氯化物过氧化物酶大亚基基因SG‐CP，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；核苷酸序列为825bp，编码274个氨基酸。 

所述的氯化物过氧化物酶编码基因通过全基因组测序和PCR扩增的方式克隆获得。 

所述的灰略红链霉菌(Streptomyces griseorubens)JSD‐1，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.5706，保藏日期为2012年1月9日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所邮编100101。 

本发明涉及上述工程菌的实现方法，以灰略红链霉菌基因组DNA为模板，与含有酶切位点的引物进行PCR扩增得到氯化物过氧化物酶编码基因；然后将该基因插入大肠杆菌表达载体pET‐22b(+)中得到含有氯化物过氧化物酶编码基因的重组表达载体；再将重组表达载体导入大肠杆菌表达菌株，筛选得到氯化物过氧化物酶的工程菌。